人参二醇组皂苷具有与地塞米松类似的改善LPS处理小鼠肾功能的作用

人参二醇组皂苷具有与地塞米松类似的改善LPS处理小鼠肾功能的作用陈燕;杜艳伟;王晓琴;付双;刘莲勤;于淇;方圆;高品;杨光【摘要】目的:研究人参二醇组皂苷(PDS)和地塞米松(DEX)是否具有类似的减轻LPS诱导的小鼠急性肾损伤(AKI)的作用，并探讨它们的作用机制•方法:C57BL/6小鼠随机分为4组，除对照组腹腔注射生理盐水外，其余3组均经腹腔注射LPS10mg/kg,PDS组和DEX组小鼠在LPS注射前1h分别经腹腔注射PDS(25.0mg/ks)或DEX(2.5mg/kg).12h后麻醉下取血和肾脏组织备生物化学与免疫印迹检测•结果LPS组小鼠血尿素氮和肌酐含量显著高于对照组(Pv0.01),而PDS组和DEX组则明显低于LPS组(Pv0.05);PDS和DEX上调LPS处理的小鼠肾组织IkB蛋白的表达，抑制NF-kB信号通路的活化，进而减少TNF-a和IL-6的产生;PDS和DEX均能下调LPS处理的小鼠肾脏诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，上调肾组织锰过氧化物歧化酶的表达，减轻肾脏的氧化应激损伤•此外,PDS和DEX均明显上调LPS处理的小鼠肾脏组织细胞核糖皮质激素受体蛋白的含量.结论:人参二醇组皂苷具有与DEX相类似的减轻LPS诱导的小鼠AKI的作用，而且，它们的作用机制相似，但PDS的药效学是否也通过糖皮质受体介导还需进一步研究.期刊名称】《中国病理生理杂志》年(卷),期】2014(030)005【总页数】6页(P864-869)关键词】脂多糖类;急性肾损伤;人参二醇组皂苷;地塞米松;小鼠作者】陈燕;杜艳伟;王晓琴;付双;刘莲勤;于淇;方圆;高品;杨光【作者单位】吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春130021;吉林大学第一医院肾病科,吉林长春130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春130021【正文语种】中文【中图分类】R329.21内毒素血症诱发的失控性全身性炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)是导致多器官功能衰竭的重要原因，而急性肾损伤(acutekidneyinjury，AKI)是其中最严重的并发症，致死率极高［1］。Annane［2］认为脓毒症诱发的SIRS中，致炎细胞因子如肿瘤坏死因子a(tumornecrosisfactora,TNF-a)等释放又可导致炎症细胞进一步激活形成炎症因子“瀑布”反应，患者处于危急状态时外源性糖皮质激素能逆转这种状态，使心血管系统恢复稳态，各器官的功能恢复，从而挽救了患者的生命。2013年Choi等［3］认为糖皮质激素可通过减轻线粒体损伤和凋亡，起到治疗脓毒性AKI的作用。实际上，糖皮质激素抢救危症和多种难治性疾病的功能很强大。尽管如此，糖皮质激素的副作用不容忽视,譬如，胃肠道应激性出血可成为各种危症患者的隐形杀手［4］。此外，肥胖、骨质疏松症和胰岛素抵抗等副作用难以防治［5］。因此，临床急需有与糖皮质激素类似疗效的而无糖皮质激素样副作用的药物。自古以来，人参汤有“起死回生”之功效。为用现代技术揭示其中的奥秘，本研究组通过系列研究发现，人参二醇组皂苷(panaxadiolsaponins,PDS)有地塞米松(dexamethasone,DEX)相类似的改善失血性休克犬心肺微循环、逆转心肺功能等作用［6］。而且，PDS没有DEX相类似的副作用。然而，PDS是否同DEX-样能够减轻脓毒症诱导的AKI,尚缺乏实验证据。因此，本研究拟在建立LPS诱导的AKI小鼠模型的基础上，对比研究PDS和DEX对LPS诱导的AKI的影响及其分子机制。材料和方法1小鼠AKI模型复制与分组C57BL/6小鼠随机分为盐水对照(control)组、LPS模型组(LPS组)、PDS+LPS组和DEX+LPS组(共计32只，n=8)。对照组经腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.5mL,其余3组分别经腹腔注射LPS10mg/kg。PDS+LPS组、DEX+LPS组小鼠在LPS注射前1h分别经腹腔注射PDS(25.0mg/kg)或DEX(2.5mg/kg)。LPS处理12h后，麻醉下取肾脏组织冻存或固定，备蛋白检测与形态学观察；采集血液，血液在室温下离心(3000r/min)10min制备血清样本，应用全自动生物化学分析仪检测小鼠血清肌酐(creatinine,CREA)和血尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)的含量。2酶联免疫法检测血清TNF-a和IL-6含量取小鼠血清，用酶联免疫法(试剂盒购自上海科敏生物技术有限公司)测定血清TNF-a和IL-6的水平。酶标仪为Bio-Tek，型号ELX800。TNF-a和IL-6的血清浓度用ng/L表示。3应用免疫印迹(Westernblotting)检测蛋白的表达3.1肾组织蛋白提取总蛋白、细胞质和细胞核蛋白的提取：将100mg肾组织用液氮研磨成粉末，并移至EP管中，再加入500~800pL组织裂解液RIPA(含PMSF和蛋白酶抑制剂)于冰上孵育10min，室温放置10min,4°C、12000r/min，离心20mino吸取上清分装，保存于-80°C。细胞核蛋白(n-pro)与细胞浆蛋白(c-pro)的提取：按NE-PER核蛋白-胞浆蛋白提取试剂盒(ThermoScientificPierce)的说明书操作，分别提取出这2种蛋白。3.2免疫印迹法检测胞质和胞核提取物及总蛋白浓度通过BCA法测定。按常规方法配制聚丙烯酰胺凝胶，依次进行SDS、转膜、封闭、抗体孵育、ECL显色。抗体包括¥孟超氧化物歧化酶(manganesesuperoxiddismutase,Mn-SOD)、诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)、糖皮质激素受体(glycocorticoidreceptor,GR)、p-IkB、IkB、p50、p65、laminBl(Abeam)和B-actin(ProteintechGroup)。辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG口抗购自ProteintechGroup(稀释度为1:10000)。3.3结果分析特异性条带的表达丰度用上海天能科技有限公司GIS凝胶图像分析系统进行灰度扫描。以B-actin或LaminBl作为内参照，各蛋白表达水平的组间比较用统计学软件分析。肾组织一氧化氮(nitricoxide,NO)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的检测肾组织NO含量检测，采用硝酸还原酶法测定；肾组织MDA检测，应用硫代巴比妥酸法。所用检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。统计学处理数据用均数士标准误(mean士SEM)表示。组间差异采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析(One-wayANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。结果LPS成功建立AKI小鼠模型，PDS和DEX均能减轻LPS诱导的AKILPS组肾脏指数明显增加,LPS组肾脏相对重量(0.0073±0.0004)显著高于对照组(0.0056±0.0005)(P<0.01)。然而,PDS和DEX组肾脏相对重量(0.0064±0.0001和0.0065±0.0001)明显低于LPS组(PvO.O5)。BUN含量LPS组为(32.31±1.76)mmol/L,对照组为(11.83±0.99)mmol/L,LPS组显著高于对照组(PvO.01)。然而，PDS+LPS组的BUN含量为(24.95±2.61)mmol/L，与DEX+LPS组的BUN含量［(24.90±2.41)mmol/L］接近，均显著低于LPS组(PvO.05)。血清CREA含量,LPS组为最高［(44.15±2.87)pmol/L］,与对照组［(16.16±1.43)pmol/L］比较差异显著(PvO.01);PDS+LPS组［(32.60±2.80)pmol/L］和DEX+LPS组［(31.77±4.60)pmol/L］接近，均明显低于LPS组(Pv0.05)，见表1。这些结果表明腹腔注射10mg/kgLPS,12h后能成功复制LPS诱导的AKI小鼠早期动物模型，并且PDS具有与DEX相类似的改善AKI小鼠肾功能的效应。表1PDS对LPS所致急性肾损伤小鼠肾脏指数、血清CREA和BUN的影响Table1.EffectsofPDSandDEXonkidneyindex,serumCREAandBUNinLPS-inducedAKImice(Mean±SD.n=8).*Pv0.05,**Pv0.01vscontrol;#Pv0.05vsLPSgroup.GroupKidneyindex(g/g)CREA(pmol/L)BUN(mmol/L)Control0.0056±0.000516.16±1.4311.83±0.99LPS0.0073±0.0004*44.15±2.87**32.31±1.76**PDS+LPS0.0064±0.0001#32.60±2.80#24.95±2.61#DEX+LPS0.0065±0.0001#31.77±4.60#24.90±2.41#PDS和DEX改善LPS诱导的AKI小鼠肾功能的作用机制PDS和DEX均能抑制LPS诱导AKI小鼠TNF-a和IL-6的产生如图1所示，LPS组血清TNF-a和IL-6含量显著高于对照组(Pv0.05,Pv0.01)。PDS组TNF-a和IL-6含量明显低于LPS组(Pv0.05),DEX组与LPS组比较，TNF-a有下降趋势,IL-6显著降低(Pv0.05)。Figure1.PDSandDEXinhibitedTNF-a(A)andIL-6(B)productioninLPS-inducedAKImice.Mean±SEM.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsLPS.图1PDS和DEX抑制LPS诱导AKI小鼠TNF-a和IL-6的产生PDS和DEX均能抑制LPS诱导AKI小鼠NF-kB信号通路的活化如图2所示，LPS组磷酸化IkB(p-IkB)蛋白表达水平与对照组比较明显增高(PvO.01),PDS组P-IkB蛋白表达水平明显低于LPS组(PvO.05),DEX组的p-IkB表达水平与LPS组比较也有降低趋势。LPS组的核NF-kBp65和p50的表达水平与对照组比较显著增高(PvO.05)。然而，与LPS组比较，PDS组和DEX组核内NF-kBp65和p50表达水平显著下调(PvO.05)。可见，PDS和DEX抑制了IkB蛋白的磷酸化水平，进而抑制了NF-kB信号通路活化，减少炎症因子产生与释放，逆转LPS诱导AKI的肾功能。PDS和DEX均能抑制LPS处理小鼠肾脏iNOS的表达和NO含量的升高LPS组肾脏组织iNOS蛋白表达水平和NO含量与对照组比较均显著增高(PvO.05)。然而，PDS组和DEX组肾脏组织iNOS蛋白表达水平和NO含量均显著低于LPS组(Pv0.05)，见图3。Figure2.PDSandDEXsuppressedNF-kappaBsignalingpathwayactivationinthekidneyofLPS-inducedAKImice.Mean±SEM.n=8.*Pv0.05vscontrol;#Pv0.05vsLPS.图2PDS和DEX抑制LPS诱导AKI小鼠NF-kB信号通路的活化Figure3.PDSandDEXreducedrenalnitricoxide(NO)production(A)andinduciblenotricoxidesnythase(iNOS)expression(B)inLPS-treatedmice.Mean士SEM.n=8.**Pv0.01vscontrol;#Pv0.05vsLPS.图3PDS和DEX抑制LPS诱导AKI小鼠肾脏组织iNOS表达和NO含量的升高PDS和DEX均能降低LPS处理小鼠肾脏MDA的含量，上调肾组织Mn-SOD蛋白的表达LPS组肾组织MDA含量与对照组比较明显增高(Pv0.05),而清除氧自由基酶Mn-SOD的蛋白表达水平明显下降(PvO.05)，见图4。LPS诱导的氧化应激加重AKI小鼠的肾脏功能障碍。然而，PDS和DEX则通过抗氧化应激作用减轻LPS诱导的AKI。Figure4.PDSandDEXup-regulatedrenalMn-SODexpression(B)anddecreasedMDAcontent(A)inLPS-treatedmice.Mean±SEM.n=8.*Pv0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsLPS.图4PDS和DEX上调AKI小鼠肾脏Mn-SOD蛋白表达并减少MDA的含量PDS与DEX均能增加LPS处理小鼠肾脏细胞核GR(nuclearGR,n-GR)的含量总GR(totalGR,t-GR)除对照组表达最低，其余3组t-GR表达水平均明显增高，组间没有显著差异。LPS组n-GR水平与对照组比较明显降低(PvO.05),PDS+LPS组和DEX+LPS组n-GR表达水平相似，均明显高于LPS组(Pv0.05),见图5。这些结果提示，PDS有可能是GR的功能配体。Figure5.PDSandDEXincreasednuclearglucocorticoidreceptor(n-GR)contentinthekidneyfromLPS-treatedmice.Mean±SEM.n=8.*Pv0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.图5PDS和DEX增加LPS诱导AKI小鼠肾脏细胞核糖皮质激素受体的含量讨论脓毒症诱发的失控性SIRS是导致多器官功能衰竭的重要原因，AKI是其中最严重的并发症，致死率极高［7］。本研究组用LPS10mg/kg腹腔注射，12h已经成功地用LPS诱导出早期AKI小鼠模型。LPS组血清BUN含量显著高于对照组；血清肌酐含量LPS组同样显著高于对照组。重要的是，PDS和DEX均能明显地改善LPS诱导AKI小鼠的肾功能，这些结果显示PDS预处理具有DEX相似的效果，均能减轻LPS诱导的AKI。为探讨PDS和DEX减轻LPS诱导的AKI的机制，我们进行了进一步研究。AKI的发病源于对促炎因子的反应，包括细胞因子分泌和活性氮氧自由基的作用［8］。譬如，TNF-a不仅仅是具有杀灭肿瘤细胞作用的细胞因子，而且，TNF-a与2个不同的受体结合，能激活不同的和重叠的信号转导通路。血管内皮细胞受TNF-a攻击后，通过接受大量的促炎信号，可增加白细胞黏附、血管渗漏和血栓形成等。因此,TNF在炎症性疾病的发病机制中起关键作用［9-10］。本研究发现，LPS组血清TNF-a和IL-6含量与对照组比较明显升高。而PDS和DEX均明显抑制LPS诱导的TNF-a和IL-6的产生。SIRS的发生与NF-kB信号通路的活化相关。在静息时抑制性蛋白IkB与NF-kB以二聚体的形式结合，以无活性的形式存在于胞浆中。然而，当细胞接受TNF-a等炎症因子刺激时，会激活IkB激酶［9］，促使IkB磷酸化，导致IkB发生泛素化和蛋白酶体降解，从而释放NF-kB,使其解离成p65和p50转入核内调节多种基因产生与释放炎症因子，诱发失控性SIRS，进而导致多器官功能损伤。本研究结果表明,LPS组p-IkB蛋白表达水平与对照组比较明显增高(PV0.01)，必然促进NF-kB的释放，核p65和p50的蛋白表达LPS组明显高于对照组(P<0.05)。p50和p65启动多种细胞因子的产生与释放，进而加重LPS诱导的AKI的肾功能损伤。而PDS+LPS组p-IkB蛋白表达水平明显低于LPS组(Pv0.05),DEX组的p-lKB表达水平与LPS组比较也有降低趋势。而且，与LPS组比较，PDS组和DEX组核内NF-kBp65和p50表达水平显著下调。可见，PDS和DEX均能抑制肾脏组织IkB蛋白的磷酸化，进而抑制肾脏NF-kB信号通路的活化。本研究还发现，PDS和DEX均能下调LPS诱导的小鼠肾组织iNOS表达，并上调Mn-SOD蛋白表达。Holthoff等［11］研究表明，白藜芦醇通过抑制活性氮自由基的活性实现了减轻脓毒症性AKI的作用。Wu等［12］研究显示选择性iNOS抑制剂L-N6-(1-iminoethyl)-lysine减轻了肾小管的氧化应激，并纠正了微循环的异常。本研究发现PDS和DEX有同样的下调LPS诱导的AKI小鼠肾脏iNOS和NO含量的作用。Kruzel等［13］研究显示,LPS诱导的氧爆发起源于线粒体，ROS是从呼吸链的复合体皿中释放的。有研究发现人参二醇组皂苷Rb1（含4个葡萄糖）可以直接与羟自由基（OH・）相互作用，保护局部缺血神经元［14］。本研究表明在LPS组线粒体特异的捕捉氧自由基的酶Mn-SOD表达水平与对照组相比明显降低。然而，PDS+LPS组和DEX+LPS组的Mn-SOD蛋白表达水平与LPS组比较被明显上调。可见，PDS和DEX均能抑制氧化应激减轻LPS诱导的AKI。众所周知，DEX通过GR发挥功能作用。DEX作为配体与GR结合导致GR活化，活化的GR以同源二聚体形式转移到核内，再与正调节的GRE结合后，能够诱导一些抗炎蛋白等表达。本研究发现PDS与DEX十分相似，均能增加肾脏组织细胞n-GR蛋白的含量。然而，PDS是否与DEX—样也会作为功能配体与GR结合导致GR活化，以配体-GR复合物的形式转入细胞核并能诱导GR的转录活性呢？我们的分析认为，PDS作为GR的功能配体可能性较大，PDS由Rb1、Rb2、Rc和Rd等组成，都在同一位置上含有糖链，在酸性环境下糖链被水解掉就会与受体相互作用，发挥甾醇的多种生理功能。Lee等［15］已经证明人参单体Rg1是核内糖皮质激素受体的功能性配体。另一种可能就是PDS可能作为一种激活剂促进糖皮质激素与GR结合，然后，以二聚体形式入核发挥作用。（致谢：人参二醇组皂苷由吉林大学天然药物研究室提供，是从人参茎叶中提取的专利产品，专利号：ZL98100070.3。发明人：马兴元、陈燕萍等。专利权人：吉林大学。）［参考文献］［1］ 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