细胞交互1.外泌体示踪

外泌体（示踪外泌体具有典型的脂质双分子层结构；参与细胞之间的交流，物质的以及正常生理过程的维持。对分离的外泌体进行体外标记或示踪，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前对于外泌体的标记方法有很多种，包括亲脂性的和膜渗透型的化合物等。一、亲脂性PKH-67，PKH-26（red）具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞研究。 实验材主要试泌体与受体细胞37℃共温育12小时；将受体细胞固定并成像。二、亲脂性羰花青实验材主要试 三、渗透型的化合物标记羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，常称为CFSE，可扩散进入细胞。这种试剂没酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。3.实3.实验材3.1.主要试3.2.主要仪4将Calcein-AM（Life,C3100MP）溶解于DMSO并将该储备溶液在过滤的孵育20分钟以允许囊泡内酯酶活性使Calcein-AM荧光。标记的细胞外囊泡悬浮液用200mLPBS稀释，然后通过流式细胞术（BectonDickinson，LSRII）进行。FSC/于荧光。使用20mM孵育与10mMCalcein-AM作为达到不同细胞外囊泡的最大荧光的标准条胞外囊泡。解螺旋http:/ 四、利用外泌体表面的巯基对外泌体进行标1中引入磺酸酯基团，使得Alexa呈负电性和亲水性，让Alexa具有更好的光学稳定性、发光强度以及pH的适应性。有研究则发现Alexa的染色亮度的光稳定性更好。C5-maleimide-Alexa488/C5-maleimide-Alexa3.2.主要仪器4C5-maleimide-Alexa488/C5-maleimide-Alexa633（200μg/ml-2.5μl）加入到含有60-100μg蛋白质的30μl细胞外囊泡等分试样中，并在孵育前用PBS补足至50μl，不搅拌，在室温环境中放置60分钟。在孵育期间，根据说明书外来体旋转柱（Invtroen（750×g管。将柱置于1.5mleppendorf管中并离心3分钟（750×g）以收集标记的细胞外囊泡。通混合至1000μl无酚红的DMEM中，然后通过0.22μm过滤器（Millex）过滤，等分并 50-60Dextran647（Dx647,100μg/ml）与细胞一起温育2小时（5％CO2,37℃，然后用PBS洗涤并重新添加完整的细胞培养基。2,37℃99mTc-HMPAO转化为亲水形式以获在细胞内。基于这一特性，99mTc-于接近的放射性示踪剂。解螺旋http:/ 实验材溶液中重构，并摇动10秒。孵育5分钟后，立即将99mTc-HMPAO加入到的细胞外囊泡中。在室温下将细胞外囊泡（100μg/100μl）与的185-370MBq的99mTc-HMPAO温育1小六、典型文献12345HwangDW,ChoiH,JangSC,etal.Noninvasiveimagingofradiolabeledexosome-mimeticnanovesicleusing(99m)Tc-HMPAO.SciRep2015;5:15636.GrayWD,MitcAJ,SearlesCD.Anaccurate,precisemethodforgenerallabelingofextracellularvesicles.MethodsX2015;2:360-7.vanderVlistEJ,Nolte-'tHoenEN,StoorvogelW,ArkesteijnGJ,WaubenMH.Fluorescentlabelingofnano-sizedvesiclesreleasedbycellsandsubsequenttativeandqualitativeysisbyhigh-resolutionflowcytometry.NatProtoc2012;7(7):1311-26.ZhengT,PuJ,ChenY,etal.smaExosomesSpreadandClusterAroundbeta-AmyloidquesinanAnimalModelofAlzheimer'sDisease.FrontAgingNeurosci2017;9:12.Roberts-DaltonHD,CocksA,Falcon-PerezJM,etal.Fluorescencelabellingofextracellularvesiclesusinganovelthiol-basedstrategyfortativeysisofcellulardeliveryandintracellulartraffic.Nanoscale2017;9(36):XuB,ZhangY,DuXF,