微生物接种和培养技术 （药品生物检定技术课件）

项目4微生物接种、分离培养技术教学培训课件接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

接种方法：斜面接种、穿刺接种等。选择一种好的接种方法，对于微生物的分离、纯化、增殖和鉴别等都很重要。

为了确保纯种不被杂菌污染，在整个过程中，必须进行严格的无菌操作。概述主要内容微生物接种技术一二微生物培养三学生实训四微生物分离纯化方法一、微生物接种技术（一）接种工具1．接种环和接种针环或针金属柄绝缘柄用于固体、液体培养基的接种用于半固体培养基的接种环（针）部分材质为白金丝或镍铬丝（一）接种工具2．玻璃涂棒在固体培养基表面将菌液均匀涂布时。主要用于液体标本的涂布接种。涂布棒是由直径为2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。（一）接种工具3．滴管或吸管用于液体接种（二）无菌操作无菌操作技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。目的：保证待测检品不被环境中微生物污染；防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。接种环境（二）无菌操作接种室接种箱超净工作台接种场所必须进行严格的消毒处理于接种之前打开接种室和超净工作台紫外灯消毒30min，同时打开风机；接种时必须关闭紫外灯要点：防止污染，严格的无菌操作接种者的双手要进行消毒处理，一般用75%酒精或0.01%新洁尔灭擦洗整个操作过程都要靠近酒精灯火焰接种工具、管、瓶口接种前后要通过灼烧灭菌棉塞不得乱放，操作中只能夹在手上不能用嘴直接吸吹吸管。不能有跑、跳等力度大的动作，以免引起空气大振动而增加染菌机会。（二）无菌操作（三）接种操作方法接种的基本程序常用接种方法液体培养基接种半固体培养基的接种斜面培养基接种法接种的基本程序灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境操作需在无菌室或超净工作台内进行无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。实验使用的物品使用前后需严格灭菌（三）接种操作方法1、液体接种法将菌种接种到液体培养基（试管、三角瓶）中的方法。接种目的：细菌的增菌培养和进行细菌的生化反应等。操作方法（三）接种操作方法液体接种法操作方法1、标记2、灼烧接种环灭菌3、取塞，灼烧管口4、冷却，取菌6、重烧管口，盖塞7、重烧接种环5、接种2、半固体培养基法：此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。（二）接种操作方法方法：用接种针沾取少许菌种，移入装有固体或半固体培养基的试管中，自培养基中心垂直刺入到底，然后按原来的穿刺线将针慢慢拔出。3、斜面接种法把各种培养条件下的菌种，接入斜面上。最常用、最基本的技术之一。用于好气性微生物的接种。（二）接种方法接种工具：接种环（1）标记：接种前在试管上注明菌名、接种日期、接种人姓名（2）点燃酒精灯。（3）接种：1）手持试管将菌种管和待接斜面管用大姆指和其他四指握在左手中，中指位于两管之间。斜面向上，尽量放平。2）旋松管塞3）接种环灼烧灭菌※斜面接种2、左手持斜面，旋松管塞1、标记3、灼烧接种环※斜面接种4）拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)※斜面接种5）取菌:接种环冷却，轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环碰到管壁，取出后带菌接种环不可通过火焰。5、冷却，取菌※斜面接种6）接种:在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面管。从斜面培养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。※斜面接种7)塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。8)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。7、重烧管口，盖塞8、重烧接种环斜面接种示意图斜面接种法及接种后菌落生长示意图

接种后菌落生长示意图菌苔(lawn)分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。稀释涂布平板法、平板划线法是分离与纯化微生物的常规方法。二、微生物的分离纯化1、平板划线分离法目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌、活菌计数。方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本。二、微生物的分离纯化连续划线分离法：最常使用的、最基本的方法，其中图B常用于含菌量较少的标本。分区划线法示意图分区划线分离要点：仅第1次划线需要取菌。其他每区划线之前一定要把残余的菌体烧掉；待接种环完全能却后通过前1区划线相隔的区域不要交叉接种环要在培养基表面划线，不要空划，也不要划破培养基整个过程要无菌操作分区划线法示意图

三段分区法四段分区法五段分区法培养后情况单菌落（clone)菌落（R型）菌苔(lawn)细菌的群体形态菌落（S型）cultureplate菌落(R型)2、倾注分离法：本法用于微生物限度检查中细菌、霉菌的计数。3、涂布分离法：主要用于活菌计数和药敏试验。1、取样2、沾燃烧酒精3、灼烧4、涂布三、微生物培养方法培养方法分类根据培养基的物理状态分类根据培养时是否需要氧气分类固体培养法液体培养法厌氧培养法需氧培养法1、固体培养法是指将微生物接种在固体培养基表面，在适宜的条件下进行生长的方法。例如平板培养、斜面培养。2、液体培养法是指将菌种接种到液体培养基内，在适宜的条件下进行生长的方法。可用于增菌。例如浅层液体培养、发酵罐培养。（一）根据培养基的物理状态分类1、需氧培养法（好气培养）在培养过程中，需加入氧气，否则不能良好生长。如大肠杆菌、金葡菌。方法：平板培养、斜面培养、通气搅拌培养、液体振荡培养2、厌氧培养法（厌气培养）这类微生物在培养时不需要氧分子参与。如破伤风杆菌、乳酸菌方法：深层液体培养；还可以用物理、化学方法、生物学方法创造无氧条件（二）根据根据培养时是否需要氧气分类1234接种工具：接种针、接种环无菌操作：创造无菌环境，重视无菌操作接种方法：液体接种、穿刺接种、划线接种等4微生物分离纯化方法：划线分离法、稀释平板涂布法5微生物的培养方法：固体培养、液体培养；好氧、厌氧培养学习小结（一）实训目的1．掌握无菌技术，树立无菌观念，能运用无菌操作技术进行细菌的接种操作；2．掌握液体接种、半固体接种、斜面接种的操作方法；3、掌握采用平板划线分离的方法；（二）材料和用具1.菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌。2.培养基：固体、半固体、液体培养基。3.仪器：酒精灯、接种环、接种针、试管架、酒精棉球、打火机、记号笔、超净工作台、电热恒温培养箱等。（三）实验内容1、细菌液体接种：将试管中的菌悬液接种倒液体培养基2、细菌斜面接种：将菌种接种倒牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基3、倒平板：每人倒至少