干扰素的生产工艺

干扰素生产工艺干扰素的生产工艺第1页汉字名称：干扰素英文名称：interferon;IFN药品类别：抗肿瘤药，抗病毒药所属类别：生物反应调整剂干扰素的生产工艺第2页干扰素介绍70年代中期人们发觉慢性乙型肝炎患者本身产生干扰素能力低下，在应用外源性干扰素后，不但产生了上述抗病毒作用，同时能够增加肝细胞膜上人白细胞组织相容性抗原密度，促进T细胞溶解感染性肝细胞效能.干扰素的生产工艺第3页现实状况当前可供临床选取干扰素种类很多。比如国产重组IFN－α1型和IFN－α2型，进口干扰能（IFN－α2b）、罗扰素（IFN－α2a）、惠福仁（类淋巴母细胞干扰素）及组合干扰素等等。干扰素的生产工艺第4页类别各种亚型干扰素-α（含α1或α2或α2a或α2b）疗效近似；干扰素-β（IFNβ）也有相同效果，但它在肌肉组织中易被灭活。干扰素-β制剂进入血液后，稳定性差，确切疗效尚在观察中，但可作为干扰素-α替换制剂。干扰素的生产工艺第5页什么是干扰素（IFN）?干扰素是由病毒和其它种类干扰素诱导剂，经过刺激网状内皮系统（人体免疫系统一个）、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生一个糖蛋白。这种蛋白含有各种生物活性，包含抗增殖、免疫调整、抗病毒和诱导分化作用。干扰素的生产工艺第6页干扰素相对分子质量小，对热稳定，4℃可保留很长时间，-20℃可长久保留其活性，56℃则被破坏，pH（酸碱度）2~10范围内干扰素不被破坏。人体自然就能产生干扰素，经一定制剂加工过程也能制造成药品-干扰素制剂。

干扰素的生产工艺第7页药理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它普通为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。2.抑制细胞增殖。干扰素抑制细胞分裂活性有显著选择性，对肿瘤细胞活性比正常细胞大500～1000倍。干扰素抗肿瘤效果能够是直接抑制肿瘤细胞增殖，或经过宿主机体免疫防御机制限制肿瘤生长。干扰素的生产工艺第8页3．诱导细胞凋亡：干扰素能够诱导肿瘤细胞凋亡，从而杀灭肿瘤细胞。4.干扰素对体液免疫、细胞免疫都有免疫调整作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定免疫增强作用。

干扰素的生产工艺第9页作用机制:干扰素不能直接灭活病毒，而是经过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。干扰素首先作用于细胞干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表示各种抗病毒蛋白，实现对病毒抑制作用。干扰素的生产工艺第10页适应症：1.用于各种恶性肿瘤，包含毛细胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期转移性肾癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。2.与其它抗肿瘤药品并用。3.作为放疗、化疗及手术辅助治疗剂。4.病毒性疾病防治。干扰素的生产工艺第11页不良反应：1.全身反应主要表现为流感样症状，即寒战、发烧和不适。2.骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板和网状红细胞降低。干扰素的生产工艺第12页3.局部反应部分患者在注射部位可出现红斑，并有压痛，二十四小时后即可消退。4.其它脱发、皮疹、血沉加紧、嗜睡、一过性肝损伤。偶见过敏性休克，用药前作过敏试验。干扰素的生产工艺第13页临床上惯用干扰素有哪些制剂自然干扰素人体白细胞重组干扰素复合干扰素干扰素的生产工艺第14页相关药品国内生产企业1.α1b干扰素中国预防医学科学院

卫生部长春生物制品研究所

卫生部上海生物制品研究所

深圳科兴生物制品有限企业（赛若金）

2.人α2a干扰素卫生部长春生物制品研究所

广州医学院

沈阳三生制药股份有限企业（因特芬）

海南新大洲药业有限企业（贝尔芬）

浙江东阳市吴守联合生物技术研究所

深圳科兴生物制品有限企业

武汉天奥制药有限企业（栓剂）干扰素的生产工艺第15页3.人α2b干扰素长春生物制品研究所安徽安科生物高科技有限企业(安达芬)

丽珠集团苏州新宝药厂（隆化诺）

哈尔滨金亚哈尔滨生物制品有限企业（利能）

上海华新生物高技术有限企业

天津华立达生物工程企业

苏州新良药厂

4.人γ干扰素上海生物化学研究所

中国预防医学科学院

卫生部上海生物制品研究所

第二军医大学

上海克隆生物高技术有限企业

珠海丽珠制药有限企业

干扰素的生产工艺第16页干扰素生产工艺路线:路线1：体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞1989年：IFNα-n3/Alferon，同意上市产量低：1gIFNα，需要3亿ml人血白细胞起源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵潜在血源性病毒污染可能性干扰素的生产工艺第17页路线2：人源转化细胞系培养生产工艺：1999年：IFNα-n1/Wellferon,同意用于临床。优点：首次实现大规模商业化生产。缺点：活性低，退出临床应用。干扰素的生产工艺第18页路线3：基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:上市产品：重组人干扰素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；－：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表示产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随即变性、复性过程。干扰素的生产工艺第19页路线4：动物无限细胞系培养生产工艺：上市产品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；，Rebif(Serono)表示产物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工艺特点：分泌表示，产量低，成本高,过程严格干扰素的生产工艺第20页路线5：基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonasputida）上市产品：IFNα-2b/安福隆表示产物：无糖基化可溶性蛋白质，含有天然分子结构和生物活性工艺特点：发酵周期短：几个小时无需变性、复性过程，取得有活性产品纯化过程：淘汰抗体亲和层析干扰素的生产工艺第21页基因工程假单胞杆菌构建与保藏基因工程假单胞杆菌菌种建立：第一步：干扰素α-2b基因克隆第二步：表示载体构建第三步：工程菌构建干扰素的生产工艺第22页第一步：干扰素α-2b基因克隆制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因连接质粒,转化E.coli,筛选判定克隆。测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。干扰素的生产工艺第23页第二步：表示载体构建IFN基因与表示载体连接转化大肠杆菌筛选阳性克隆取得序列正确表示载体干扰素的生产工艺第24页第三步：工程菌构建转化假单胞杆筛选高表示、稳定遗传工程菌取得原始菌种干扰素的生产工艺第25页菌种库建立与保藏QC：菌种特征、生产能力、质粒稳定性菌种检验合格后，方可投产。干扰素的生产工艺第26页干扰素α-2b发酵工艺过程干扰素的生产工艺第27页摇瓶培养：取保留工作种子批菌种，室温融化摇瓶培养：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测：OD值和发酵液杂菌检验。干扰素的生产工艺第28页种子罐培养：接种：接入50L种子罐，接种量10%。培养：30℃，pH7.0。控制：级联调整通气量和搅拌转速检测：显微镜和LB培养基划线检验，控制杂菌。干扰素的生产工艺第29页发酵罐培养：接种：通入300L培养基发酵罐，接种量10%。控制：级联调整通气量和搅拌转速。前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。检测：发酵液杂菌检验干扰素的生产工艺第30页菌体搜集：连续流离心机：冷却发酵液，16000r/min离心搜集。菌体保留：－20℃冰柜，不超出12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。干扰素的生产工艺第31页干扰素α-2b分离工艺过程菌体裂解预处理离心初级分离干扰素的生产工艺第32页1.菌体裂解：裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保护剂：EDTA，PMSF。破碎－20℃菌体：2厘米以下碎块搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。干扰素的生产工艺第33页2.预处理-沉淀：加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。干扰素的生产工艺第34页3.离心：连续流离心机：2℃～10℃，16000r/min搜集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121℃、30min蒸汽灭菌,焚烧处理。干扰素的生产工艺第35页4.初级分离：盐析:4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000r/min保留：搜集沉淀，粗干扰素，4℃保留。干扰素的生产工艺第36页干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装干扰素的生产工艺第37页1.溶解粗干扰素配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45μm滤器和10ku超滤系统，百级层流下搜集。冷却至2℃～10℃。检验:缓冲液pH值和电导值。溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。干扰素的生产工艺第38页2.沉淀与疏水层析等电点沉淀（1）：磷酸调整至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心搜集上清液。疏水层析：洗脱与搜集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。等电点沉淀（2）：磷酸调整pH4.5，调整电导值40ms/cm，2℃～10℃，静置过夜干扰素的生产工艺第39页超滤：1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。透析除盐：调整溶液pH8.0，电导值，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。干扰素的生产工艺第40页4.阳离子交换层析与浓缩用0.1M醋酸缓冲液（pH5.0）平衡树脂。上样，相同缓冲液冲洗。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进行洗脱配合SDS搜集干扰素峰。浓缩：10ku超滤膜进行。干扰素的生产工艺第41页5.凝胶过滤层析洗涤液：0.15MNaCl0.01