细菌内毒素检查法

细菌内毒素检查法第一页，共四十四页，2022年，8月28日一、基本概念细菌内毒素与热原的关系热原(Progen)

指临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质。关于热原的定义在学术上还有争论。细菌内毒素(Endotxin)

革兰氏阴性细菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活性，其化学结构是脂多糖(LPS)。热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但在GMP的条件下，在药检的范畴里，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就控制热原。第二页，共四十四页，2022年，8月28日一、基本概念细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中的细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方式，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。第三页，共四十四页，2022年，8月28日一、基本概念细菌内毒素的量用内毒素单位(EU或IU)表示。细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。第四页，共四十四页，2022年，8月28日一、基本概念细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰的灭菌注射用水。试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤30分钟以上，也可以采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。试验操作过程应防止微生物的污染。第五页，共四十四页，2022年，8月28日二、细菌内毒素检查法(凝胶限量法)细菌内毒素检查法（凝胶法）实验程序如下：一、实验准备：试剂、仪器、及用具等二、确定药品的细菌内毒素限值（L）三、计算供试品的最大有效稀释倍数（MVD）或最低有效浓度（MVC）四、鲎试剂灵敏度复核五、药品与鲎试剂相容性的初筛试验六、供试品干扰试验以及干扰试验的验证七、供试品日常的内毒素限量检查。第六页，共四十四页，2022年，8月28日三、实验准备1.仪器、设备

37±1℃恒温水浴或适宜的恒温器具2.器具：凡与供试品或试剂直接接触的器具必须经除热原处理（250℃干烤30min以上）;塑料用具须确证不干扰实验结果.3.试剂内毒素工作标准品、鲎试剂、鲎试验用水、

PH调节剂。

第七页，共四十四页，2022年，8月28日四、确定药品的细菌内毒素限值（L）L=K/ML:供试品的内毒素限值,可从《药典》上查询或按以上公式计算,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示K:按照规定的给药途径,人体每公斤体重每小时可接受的最大内毒素剂量,以EU/(kg.h)表示;M:人体每公斤体重每小时最大用药剂量,以ml／(kg.h)、mg／(kg.h)或U／(kg.h)表示，中国人均体重按60公斤计算，人体表面积按1.62m2计算。按注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M)。第八页，共四十四页，2022年，8月28日五、鲎试剂灵敏度复核

1.鲎试剂灵敏度定义：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。2.目的

2.1考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，

2.2考察试验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。3.鲎试剂灵敏度复核的条件

3.1使用新批号的鲎试剂，

3.2试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时。第九页，共四十四页，2022年，8月28日五、鲎试剂灵敏度复核4.溶液配制

注：A为内毒素水溶液系列；B为阴性对照编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ

4

444B无／检查用水---------------2第十页，共四十四页，2022年，8月28日五、鲎试剂灵敏度复核5.反应加样6.结果判断：反应管倒转180°

阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性(-)：无凝胶或凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者内毒素浓度(EU／ml)2λλ0.5λ0.25λNC0.1ml鲎试剂○○○○○○○○○○○○○○○○○○反应条件37±1℃，60min±2min第十一页，共四十四页，2022年，8月28日五、鲎试剂灵敏度复核试验有效性判断

NC管必须全部为阴性(--)TAL与内毒素水溶液系列：

2λ管均为阳性(++++)，

0.25λ管均为阴性(----)

符合以上条件试验有效第十二页，共四十四页，2022年，8月28日五、鲎试剂灵敏度复核结果计算鲎试剂灵敏度的测定值(λc)计算：

λc=antilg(∑X／4)X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当0.5λ≤λc≤2λ时，以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。第十三页，共四十四页，2022年，8月28日六、鲎试剂灵敏度的选择

一般为了试验的方便，选择灵敏度低的鲎试剂，若供试品的限值很小，则应选择灵敏度高的鲎试剂，方便供试品溶液的稀释和PPC（供试品阳性对照）的制备。

第十四页，共四十四页，2022年，8月28日七、供试品溶液的制备供试品溶液的最大稀释倍数的计算

MVD＝CL/λL:供试品的内毒素限值；

C：供试品溶液的浓度；当L以EU/ml表示时，C为1ml/ml;当L以EU/mg或EU/u表示时，C的单位为mg/ml或u/ml(注意：当L以EU/ml表示时，C的值不是样品的浓度，就是1)。第十五页，共四十四页，2022年，8月28日七、供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。(USP、EP一般要求供试品溶液与鲎试剂的混合液的PH值在6.0～8.0的范围内。）

对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需要调节被测溶液(或其稀释液)的PH值。第十六页，共四十四页，2022年，8月28日

八、药品与鲎试剂相容性初筛试验1.目的：通过一系列浓度的试验，筛选出对鲎试验无干扰的浓度2.作用：确定以后对样品作BET常规检查的两个主要参数：样品的有效稀释范围或有效浓度范围，可选择的鲎试剂的灵敏度范围。减少干扰试验的盲目性节省时间以及成本。第十七页，共四十四页，2022年，8月28日九、供试品的干扰试验1.目的：判断某种检品在某种浓度下是否适合作内毒素检查。2.原理：比较鲎试剂与内毒素的反应在水溶液中进行和在检品中进行的差异,也即是比较反应在不同介质中进行反应的差异,无差异即无干扰,有差异即有干扰。若没有干扰，该浓度可以进行日常检查；若有干扰，则必须排除干扰后才能进行日常检查。第十八页，共四十四页，2022年，8月28日九、供试品的干扰试验3.在何种情况下需做干扰试验：新品种建立方法鲎试剂的来源改变鲎试剂的配方、生产工艺改变供试品的来源改变供试品的配方、生产工艺改变试验环境中发生了其它有可能影响试验结果的变化。第十九页，共四十四页，2022年，8月28日九、供试品的干扰试验编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/检查用水---------------2B2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/供试品溶液供试品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D无/供试品溶液---------------2①注：A为阴性对照；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为供试品溶液①

USP、EP规定为4支平行管凝胶法干扰试验溶液的制备第二十页，共四十四页，2022年，8月28日九、供试品的干扰试验加样反应NCB溶液(PC系列)C溶液(PPC系列)供试品管内毒素浓度(Eu／ml)----2λλ0.5λ0.25λ2λλ0.5λ0.25λ----平行管○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○反应条件37±1℃，60min±2min第二十一页，共四十四页，2022年，8月28日十、干扰试验结果分析

试验有效性判断

---NC管必须全部为阴性

---供试品管必须为阴性

---TAL与内毒素水溶液系列：

2λ管均为阳性(++++)，

0.25λ管均为阴性(----)

即0.5λ≤Es≤2λ

符合以上条件试验有效。

λ

第二十二页，共四十四页，2022年，8月28日十、干扰试验结果分析按下式计算系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)Es=antilg(∑Xs／4)Et=antilg(∑Xt／4)Xs和Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)。当0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。USP、EP规定当0.5λ≤Es≤2λ且0.5λ≤Et≤2λ时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。第二十三页，共四十四页，2022年，8月28日十、干扰试验结果分析反应结果1(SD表示供试品溶液)E0.5

E0.25

E0.125

E0.06NCEs

++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5

SDE0.25

SDE0.125

SDE0.06NPCEt

++++++++----------0.25Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且Es=Et,干扰成立第二十四页，共四十四页，2022年，8月28日十、干扰试验结果分析反应结果2：E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++----------0.25Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且Et=2Es,干扰成立第二十五页，共四十四页，2022年，8月28日十、干扰试验结果分析反应结果3：E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++++++------0.125Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且

Et

=0.5Es,干扰成立第二十六页，共四十四页，2022年，8月28日十、干扰试验结果分析反应结果4：增强E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu／ml按中国药典判断：试验有效，但内毒素供试品溶液系列不符合0.5Es≤Et≤2Es

，则认为干扰试验不成立，即供试品在试验浓度下有干扰作用。

按USP、EP判断:内毒素供试品溶液系列0.25λ管（SDE0.5）中有一管呈阳性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求,则认为干扰试验不成立，即供试品在试验浓度下有干扰作用。第二十七页，共四十四页，2022年，8月28日十、干扰试验结果分析反应结果5：增强E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu／ml按中国药典判断:试验有效，符合0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

，则认为干扰试验成立,即供试品在试验浓度下无干扰作用。按USP、EP判断:

内毒素供试品溶液系列0.25λ管（SDE0.5）中有一管呈阳性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求，则认为干扰试验不成立,即供试品在试验浓度下有干扰作用。第二十八页，共四十四页，2022年，8月28日十、干扰试验结果分析反应结果6：抑制E0.5

E0.25

E0.125

E0.06NC

++++++++----------SDE0.5

SDE0.25

SDE0.125

SDE0.06NPC

+++---------------

内毒素供试品溶液系列2λ管（SDE0.5）中有一管呈阴性，供试品在该浓度下对凝胶反应有抑制作用。第二十九页，共四十四页，2022年，8月28日十、干扰试验结果分析反应结果7：抑制E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt

++++--------------0.5Eu／ml按中国药典:0.5λ≤Es≤

2λ但

Et

＞2Es,干扰不成立。认为供试品在试验浓度下对凝胶反应有抑制作用.按USP、EP:0.5λ≤Es≤

2λ且0.5λ≤

Et≤

2λ

干扰成立。认为供试品在试验浓度下对凝胶反应无干扰作用.第三十页，共四十四页，2022年，8月28日十一、举例：某产品的干扰试验1.试剂试剂名称厂家规格灵敏度或效价数量鲎试剂湛江安度斯0.1ml/支0.25Eu/ml36支工作标准品中国药品生物制品检验所-------150EU/支1支BET水湛江安度斯50ml/瓶-------------PH调节剂湛江安度斯2ml/支-------1支某产品-------100ml:0.4g-------1瓶第三十一页，共四十四页，2022年，8月28日十一、举例：某产品的干扰试验2.制备某产品供试品溶液某产品内毒素限值L≤0.6EU/mg最大有效稀释倍数MVD=(4mg/ml×0.6EU/mg)/0.25EU/ml=9.6选择稀释倍数为8倍,则其供试液的浓度为0.5mg/ml。供试液(S8)的制备

2.0ml供试品+13.4mlBET水+0.6mlOH-,PH=7.0第三十二页，共四十四页，2022年，8月28日十一、举例：某产品的干扰试验3.内毒素标准品溶液的制备细菌内毒素标准品溶液和内毒素供试品溶液的制备：分别用鲎试剂和供试品溶液将同一支内毒素标准品按以下步骤稀释：

0.2ml0.2ml1.0ml

150EU/ml15EU/ml1.5EU/ml0.5EU/ml1.8ml1.8ml2.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml1.0ml1.0ml第三十三页，共四十四页，2022年，8月28日十一、举例：某产品的干扰试验4.反应结果NCB溶液(PC系列)反应终点浓度C溶液(PPC系列)反应终点浓度供试品管内毒素浓度(Eu╱ml)---0.50.250.1250.060.50.250.1250.06----平行管-++--0.25++--0.25--++--0.25++--0.25-／++--0.25+---0.5／／++--0.25++--0.25／反应条件37±1℃，60min±2min第三十四页，共四十四页，2022年，8月28日十一、举例：某产品的干扰试验

5.结果分析试验有效性判断：

NC管必须全部为阴性

NPC管必须全部为阴性

TAL与内毒素水溶液系列：

2λ管均为阳性(++++)，0.25λ管均为阴性(----)

试验结果符合以上条件，试验有效。

λ

第三十五页，共四十四页，2022年，8月28日十一、举例：某产品的干扰试验按下式计算系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)

Es=antilg(∑Xs／4)=antilg［(lg0.25Eu／ml×4)／4］=0.25Eu／mlEt=antilg

(∑Xt／4)=antilg［(lg0.25Eu／ml×3+lg0.5Eu／ml)／4］=0.297Eu／ml0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

，供试品在0.5mg／ml浓度下无干扰作用。第三十六页，共四十四页，2022年，8月28日十二、消除干扰的方法

供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。

1.供试品稀释法

MVD=CL/λ

鲎试剂灵敏度(λ)越高(数值越小)，供试品的稀释倍数越大，干扰越小。第三十七页，共四十四页，2022年，8月28日十二、消除干扰的方法

2.物理方法如加热法(血液制品)、冷析法(甘露醇)3.化学方法如调节PH值(奎诺酮类)、调节金属离子(血液保养液、FDP)4.生物方法如抗增液的使用，阻断G因子反应，防止假阳性；

5.其它方法如过滤法、溶剂抽提等第三十八页，共四十四页，2022年，8月28日十三、检品的日常检查

1.经过干扰试验的验证后，则可进行检品的日常内毒素检查，检查法的反应管按以下设置：

注：A为供试品溶液；B供试品阳性对照(PPC)；C为阳性对照(PC)；D为阴性对照(NC)