酶抑制剂和反应动力学专家讲座

第二章

酶抑制剂及反应动力学酶抑制剂和反应动力学专家讲座第1页第一节酶抑制作用概念和分类一概念二抑制程度表示三抑制作用分类四抑制作用定义酶抑制剂和反应动力学专家讲座第2页1.

失活作用2.抑制作用3.去激活作用4.阻遏作用一概念：能降低酶催化反应速度原因酶抑制剂和反应动力学专家讲座第3页1.失活作用失活作用是指因为一些物理原因和化学试剂部分或全部破坏了酶三维结构，即引发酶蛋白变性，造成部分或全部丧失活性。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第4页2.抑制作用抑制作用是指在酶不变性情况下，因为必需基团或活性中心化学性质改变而引发酶活性降低或丧失。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第5页3.去激活作用去激活作用，一些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引发这些酶活性降低或丧失。去激活作用经过去除金属离子而间接地影响酶活性。当金属离子去除后，底物与酶结合降低，实际上是降低了底物有效浓度。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第6页4.阻遏作用阻遏作用指一些原因（如激素或药品等）使细胞内酶蛋白合成降低，反应速度降低是因为酶分子数量降低，每分子酶催化效力并无改变，而抑制作用是指一定量酶分子催化效力降低，不包括酶分子合成问题。二．抑制程度表示酶抑制剂和反应动力学专家讲座第7页二．抑制程度表示

普通用反应速度改变来表示。若以不加抑制剂时反应速度为Vo，加入抑制剂后反应速度为Vi，则酶抑制程度有以下几个表示方法：酶抑制剂和反应动力学专家讲座第8页二．抑制程度表示1．相对活力分数（残余活力分数）

a=Vi/Vo2．相对活力百分数（残余活力百分数）

a%==Vi/Vo*100%3．抑制分数指被抑制而失去活力分数i=1-a=1-Vi/Vo4．抑制百分数

i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100%

通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第9页三.抑制作用分类

不可逆抑制作用（非专一性不可逆抑制作用；专一性不可逆抑制作用）可逆抑制作用（竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用，反竞争性抑制作用，混合型抑制）酶抑制剂和反应动力学专家讲座第10页四.抑制作用定义不可逆抑制作用

抑制剂与酶分子上某必需基团以共价键结合，使酶失活，不能用透析、过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。

三.抑制作用分类酶抑制剂和反应动力学专家讲座第11页四.抑制作用定义有些不可逆抑制剂能与酶分子中一类或几类基团反应，称为非专一性不可逆抑制剂。

重金属离子：共价结合巯基、氨基和吲哚基，从而使酶失活。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第12页四.抑制作用定义Ks型不可逆抑制剂：依据底物化学结构而设计抑制剂，含有和底物类似结构，能够和对应酶相结合，同时所带活泼化学基团化学修饰酶分子中必需基团从而抑制酶活性。这种抑制剂是经过其对酶亲和力而对酶进行修饰标识，所以又称亲和标识试剂。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第13页Kcat（catalyze)型不可逆抑制剂(自杀性底物)：含有与天然底物相类似结构，本身也是酶底物，被酶催化后，潜伏性反应基团因酶催化而暴露或活化，作用于酶活性中心或辅基，使酶被共价修饰而失活。E+SsESsEI酶抑制剂和反应动力学专家讲座第14页自杀性底物克拉维酸在抑制β—内酰胺酶过程中，既为酶底物又为酶抑制剂,当每一个酶分子被不可逆钝化，约有115个克拉维酸分子作为底物被破坏。三.抑制作用分类酶抑制剂和反应动力学专家讲座第15页四.抑制作用定义抑制剂与酶以非共价键结合而引发酶活性降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活者称为可逆抑制作用。动画酶抑制剂和反应动力学专家讲座第16页五可逆抑制作用和不可逆抑制作用判别1.物理方法用透析、超滤和凝胶过滤等方法是否能除去抑制剂来判别可逆抑制作用和不可逆抑制作用。2.动力学方法在测定酶活力系统中加入一定量抑制剂，测定酶反应初速度，以初速度和酶浓度作图。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第17页四.抑制作用定义酶抑制剂和反应动力学专家讲座第18页第二节酶抑制剂及其应用一概述酶抑制剂（Enzymeinhibitor)：使酶活性降低乃至完全丧失活性配体。

IC50：酶活性抑制50%时所需酶抑制剂浓度。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第19页二酶抑制剂应用酶抑制剂和反应动力学专家讲座第20页保健药品

美容药品

农用药品

酶抑制剂和反应动力学专家讲座第21页医药领域应用二氢叶酸合成酶对氨基苯甲酸二氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶酶抑制剂和反应动力学专家讲座第22页转肽基酶酶抑制剂和反应动力学专家讲座第23页痛风病药品作用机理酶抑制剂和反应动力学专家讲座第24页药物被抑制酶治疗机理概要磺胺二氢叶酸合成酶抗菌。苯甲酸类似物；核酸合成障碍。氨基蝶呤，氨甲蝶呤二氢叶酸还原酶抗白血病。FH4合成障碍；核酸合成障碍。青霉素，β-氟代-D-丙氨酸细菌转肽酶抗菌。酶自杀底物；胞壁合成障碍。5-氟尿嘧啶(尿嘧啶类似物）尿苷磷酸化酶抗癌。酶自杀底物；肿瘤细胞不能合成核酸。5-氟脱氧尿苷酸胸苷酸合成酶抗癌。酶自杀底物；肿瘤细胞不能合成DNA。一些药品对酶抑制效应酶抑制剂和反应动力学专家讲座第25页药物被抑制酶治疗机理概要别嘌呤醇黄嘌呤氧化酶抗痛风。酶自杀底物；抑制尿酸生成。优降宁线粒体单胺氧化酶降血压。降低去甲肾上腺素在血管上积累。开搏通(巯基甲脯氨酸)血管担心素转化酶降血压。自杀性底物；抑制血管担心素Ⅱ生成。阿卡波糖α-葡萄糖苷酶治疗糖尿病。酶竞争性抑制剂；降低血糖。一些药品对酶抑制效应酶抑制剂和反应动力学专家讲座第26页酪氨酸酶（微生物产黑色素关键酶）L-多巴（DOPA）黑色素酪氨酸酶抑制剂（曲酸）酪氨酸酶抑制剂和反应动力学专家讲座第27页肉毒素小分子抑制剂肉毒素是由两个肽链组成，一个重链和一个轻链。重链靶向并结合到神经末梢表面受体。这么肉毒素就可进入神经末梢内部。一旦进入，轻链就与重链分离，切断控制神经肌肉功效特异蛋白。这些蛋白破坏有效阻止了引发肌肉收缩神经递质释放，而肌肉收缩是呼吸所必需。肉毒素侵入神经末梢结果就是造成瘫痪，最终造成窒息和死亡。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第28页农业领域

胆碱酯酶:胆碱酯酶催化胆碱酯生成乙酰胆碱（神经系统受体），缺乏受体造成昆虫神经系统紊乱，痉挛而死。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第29页构建抗除草剂工程植物机理

（1）提升除草剂作用靶酶剂量

EPSP合成酶生理作用与草甘膦抑制作用EPSP合成酶:5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶EPSP合成酶是芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中关键酶，芳香族氨基酸参加植物体内一些生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、酚类物质等次生代谢。EPSP芳香族氨基酸主要物质次生代谢草甘膦施用后被植物快速吸收，并随同化产物传导至整个植株，因其阻断了芳香族氨基酸生物合成，对植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢过程产生影响而造成植物死亡（竞争抑制，非选择性）。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第30页植物5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶cDNA克隆连接CaMV开启子，经过Ti质粒载体导入矮牵牛当前已将这种修饰过基因导入烟草和矮牵牛，并产生了抗性（竞争抑制，非选择性）酶抑制剂和反应动力学专家讲座第31页构建抗除草剂工程植物机理

（2）引入除草剂钝化酶

谷氨酰胺合成酶(GS)及其抑制剂膦丝菌素GS生理功效及酶学特征谷氨酰胺合成酶（glutaminesynthetase(GS)，催化无机氮向有机氮转化反应，植物体中GS是将氨固定到有机物当中。膦丝菌素（PPT）抑制机理无机氮GS有机氮PPT-CoABar酶抑制剂和反应动力学专家讲座第32页从链霉菌中克隆编码使膦丝菌素乙酰化而失活酶基因连接CaMV开启子，并将其转化到土豆Bar基因，能合成乙酰转移酶，解除非选择性除草剂PPT对植物谷氨酰胺酶抑制，防止植物细胞因为氨积累而死亡。当前已将这个基因导入小麦、烟草、马铃薯、甜菜等作物，其中转基因马铃薯已进行大田试验并取得良好效果。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第33页构建抗除草剂工程植物机理

（3）降低植物作用靶酶对除草剂敏感性

突变avoA基因，它合成EPSP酶脯氨酸被丝氨酸所取代，酶活力不受影响，不过对非选择性除草剂草甘膦结协力只有原来25%，从而使植物对除草剂表现不敏感。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第34页三酶制剂制备1产酶抑制剂微生物优势：毒性小，针对性强适合治疗起源广泛，种类多适合大规模生产微生物体内，二者共存，为寻找酶制剂指明方向酶抑制剂和反应动力学专家讲座第35页2组合化学法基于化学合成与计算机技术相结合组合化学法是酶抑制剂筛选全新方法,其基本原理是借助组合合成仪同时合成出大量不一样化合物,并经过高通量群集筛选技术得到最有潜力先导物.酶抑制剂和反应动力学专家讲座第36页3高通量筛选法高通量筛选法是在传统筛选技术基础上,将先进分子生物学,细胞生物学,计算机,自动化控制等各种技术方法有机结合而形成,更适合酶抑制剂筛选技术体系,当前已经用于新药筛选.酶抑制剂和反应动力学专家讲座第37页一高通量筛选(HighThroughputScreening)靶标(酶)测试各种化合物对靶标产生预想结果化合物(Hit)先导物目标物四酶抑制剂筛选酶抑制剂和反应动力学专家讲座第38页二建立筛选模型分子水平药品筛选模型:受体筛选;酶筛选;离子通道筛选.细胞水平药品筛选模型:细胞调亡;转录调控;信号传导;细菌生长;细菌蛋白分泌

酶抑制剂和反应动力学专家讲座第39页第三节有抑制酶反应动力学

一：双曲线：1902年，研究蔗糖酶催化蔗糖水解反应第一段：一级反应反应速度只与反应物浓度一次方成正比第二段：混合反应第三段：零级反应反应速度与反应物浓度无关酶抑制剂和反应动力学专家讲座第40页米-曼模式使用以下酶催化概念E+SESE+P米-曼推导公式描述出试验观察结果.V0=Vmax[S]/（Km+[S]）米-曼在推导此公式时,要求一新常数即Km,称为米氏常数(单位:mol/L)Km=(K-1+K2)/K1k1K-1k2酶抑制剂和反应动力学专家讲座第41页二：双倒数做图（Lineweaver-Burk）双倒数图是测定抑制剂怎样与酶结合有用方法酶抑制剂和反应动力学专家讲座第42页1．竞争性抑制动力学若在反应体系中存在有与底物结构相类似物质，该物质能在酶活性部位上结合，从而妨碍了酶与底物结合，使酶催化底物反应速率下降。这种抑制称为竞争性抑制。例1：底物类似物二氢叶酸合成酶：对氨基苯甲酸→二氢叶酸其竞争性抑制剂：对氨基苯磺酸酶抑制剂和反应动力学专家讲座第43页反应式

E+SESE+P+IEIKsk2Ki酶抑制剂和反应动力学专家讲座第44页

Vo=Vm[S]/(αKm+[S])

animation

α=1+[I]/KiKi=[E][I]/[EI]（1/Vo=Y）Y=αKmX/Vm（1/[S]=X）+1/Vm1）当[I]=0，α=1，当X=0时，在Y轴上截距为1/Vm，当Y=0时，在X轴上截距为-1/Km2）假设[I]=Ki，α=2，当X=0时，在Y轴上截距为1/Vm，当Y=0时，在X轴上截距为-1/2Km3）假设[I]=3Ki，α=4，酶抑制剂和反应动力学专家讲座第45页竞争性抑制动力学主要特点是增大米氏常数(即亲和力下降)，即当[I]增加，或KI减小，都将使KmI增大，反应速率下降，但Vm不变,因为能够经过增加底物浓度解除抑制。V0：抑制后反应速度Km：米氏常数Ki：抑制常数（酶抑制剂复合物解离常数）KmI：加入抑制剂后米氏常数酶抑制剂和反应动力学专家讲座第46页2、反竞争性抑制抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物ES相结合生成ESI复合物。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第47页

反应式

E+SESE+P+IESIKsk2Ki’酶抑制剂和反应动力学专家讲座第48页

动力学方程：Vo=Vm[S]/(Km+α’[S])

α’=1+[I]/Ki’Ki’=[ES][I]/[ESI]Y=KmX/Vm+α’/Vm1）当[I]=0，α’=1，当X=0时，在Y轴上截距为1/Vm，当Y=0时，在X轴上截距为-1/Km2）假设[I]=0.5Ki’，α’=1.5，当X=0时，在Y轴上截距为1.5/Vm，当Y=0时，在X轴上截距为–1.5/Km动画酶抑制剂和反应动力学专家讲座第49页反竞争性抑制使得Vm下降，Km下降，下降倍数为α’=(1+[I]/Ki’)。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第50页3．非竞争性抑制动力学

或线性混合型抑制作用若抑制剂在酶底物结合部位以外必需基团与酶相结合，而且这种结合与底物结合没有竞争关系，这种抑制称为非竞争性抑制或线性混合型抑制作用。

酶抑制剂和反应动力学专家讲座第51页酶抑制剂和反应动力学专家讲座第52页

反应式

E+SESE+P++IIEI+SESI

Ki：EI复合物或EIS复合物解离常数(非竞争性抑制常数)Ks：ES复合物或EIS复合物解离常数Ksk2Ks’Ki’Ki酶抑制剂和反应动力学专家讲座第53页线性混合型抑制基本上与非竞争性抑制相同。但因为I和E结合改变了底物解离常数Ks，S与E结合改变了抑制剂从复合物上解离常数Ki。（Ks≠K's，Ki≠K'i）酶抑制剂和反应动力学专家讲座第54页动力学方程：Vo=Vm[S]/(αKm+α’[S])

α=1+[I]/Ki’α’=1+[I]/KiKi=[E][I]/[EI]Ki’=[ES][I]/[ESI]’Y=αKmX/Vm+α’/Vm酶抑制剂和反应动力学专家讲座第55页1）当[I]=0，略2）假设[I]=0.5Ki=0.25Ki’(Ki<Ki’)当X=0时，在Y轴上截距为α’/Vm，当Y=0时，在X轴上截距为-α’/αKm(α’/α<1)酶抑制剂和反应动力学专家讲座第56页Ki<Ki’?Vm下降,KmI增大,非竞争与竞争混合,相交于第二相限Ki>Ki’?Vm下降,KmI减小,非竞争与反竞争混合,相交于第三相限当Ki＝K‘i时，α=α’,为非竞争性抑剂;；当K’i→∞时，α’=1,为竞争性抑制；当Ki→∞时，α=1,为反竞争性抑制;当Ki≠K'i且均为常数值时为线性混合抑制。若无ESI存在，则为竞争性抑制；若无EI存在，且ESI无反应活性，则为反竞争性抑制；若E和底物结合并不能影响E和I结合，且ESI无反应活性，则为非竞争性抑制。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第57页1）当[I]=0，α=1，略2）假设[I]=Ki，α=α’

=2，当X=0时，在Y轴上截距为2/Vm，当Y=0时，在X轴上截距为-1/Km非竞争性抑制，使最大反应速率下降，下降倍数为α’=(1+[I]/Ki’)，Km不变。酶抑制剂和反应动力学专家讲座第58页4．底物抑制动力学因为底物浓度增大而引发反应速率下降作用，称为底物抑制作用。

E+SESE+P+SES2ES2为不含有催化反应活性，不能分解为产物三元复合物。k1k2Ksik-1酶抑制剂和反应动力学专家讲座第59页动力学方程：Vo=Vm[S]/(Km+α’[S])

α’=1+[S]/KsiKsi=[ES][S]/[ES2]底物抑制解离常数Y=KmX/Vm+α’/Vm在低底物浓度,[S]/Ksi<<1,α’=1,无底物抑制作用Vo=Vm[S]/(Km+[S])1/V-1/S做图为一条直线在高底物浓度,有底物抑制作用1/Vo=(Km+α’[S])/Vm[S]=Km/Vm[S]+α’/Vm=α’/Vm=1/Vm+[S]/KsiVm1/V-S做图为一条直线酶抑制剂和反应动力学专家讲座第60页酶抑制剂和反应动力学专家讲座第61页5.产物(反馈）抑制产物与酶形成复合物EP后，就停顿继续进行反应。

E+SESE+P+P

EP+SEP为无活性端点复合物动力学方程：Vo=Vm[S]/(αKm+[S])α=1+P/KP

[I]是变量以P表示酶抑制剂和反应动力学专家讲座第62页例题1在含有相同酶浓度五个反应物系中，分别加入不一样浓度底物并测定其初始速度，然后再在一样五个反应物系中分别加入浓度为2.210-1mmol/L抑制剂，并测其初始反应速率，其数据见下表。

底物初始浓度（S）mmol/L无抑制时速率(Vs)mmol/Lmin有抑制时速率(Vi)mmol/LLmin0.128180.1536240.2043300.5063510.707463酶抑制剂和反应动力学专家讲座第63页试依据上述数据决定其抑制类型及动力学参数值Ki。解：以L－B作图法来判断抑制，类型并求其参数。将上述试验数据分别取其倒数，以1／V对1／S作图得到下列图所表示两条直线，它们在纵轴上有一公共交点，这表明该抑制为竞争性抑制。依据图可得Vm=100mmol/(L.min)Km=0.24mmol/L

αKm=0.44

求得Ki=0.27mmol/L酶抑制剂和反应动力学专家讲座第64页幻灯