常用分子生物学技术的原理及其应用

第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridizationandBlottingTechniqueDNA的变性和复性

目录复性RNADNA探针标记技术

探针(probe)???已知序列的多聚核苷酸片段可被标记:同位素、生物素或荧光染料可被检测

一、基本概念核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)：不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂化双链。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。探针(Probe)：是带有特殊可检测标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样品中存在的特定基因。印迹技术(BlottingTechnique)：

将生物大分子物质，核酸或蛋白质进行凝胶电泳分离成若干条带后，转移（印迹）到固化介质（常用NC膜、尼龙膜）上，再与探针进行杂交的反应。印迹技术二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹

(SouthernBlot)（二）RNA印迹(NorthernBlot)（三）蛋白质的印迹

(WesternBlot)用于基因组特异基因的定位及检测，重组质粒和噬菌体的分析。

用于RNA的定性分析.比较不同组织和细胞中同一基因的表达情况。用于蛋白质定性,半定量及蛋白质相互作用研究。其他：斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA芯片技术(DNAchip)（一）DNA印迹(SouthernBlot)1、概念：将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上，再通过特异性探针的杂交检测被转移的DNA片段的一种方法。这是由E.Southern于1975年首先设计应用的，因而以其姓氏命名。核酸电泳琼脂糖凝胶电泳

分子杂交实验①②③2、基本过程：（1）酶切：用限制性内切酶消化DNA样品（2）电泳：通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段按小分离（3）变性：将含有DNA区带的凝胶在变性溶液中变性（4）转移：使胶中的DNA分子转移到固相支持物（NC膜或尼龙膜）上（5）固定：在80℃真空条件下加热或在紫外交联仪内处理使DNA固定于膜上（6）杂交3、应用：用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹(NorthernBlot)：1、利用与DNA印迹相类似的技术分析RNA就称为RNAblot。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northernblot。2、基本过程：

与SouthernBlot相似，但有以下不同：RNA分子较小，在转移前无需进行限制性内切酶切割变性RNA的转移效率比较高3、应用：（1）检测某一组织或细胞中已知的特异

mRNA的表达水平（2）比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况（三）蛋白质印迹(WesternBlot)

1、概念：蛋白质在电泳之后可以被从胶中转移和固定到模型材料上，再与溶液中相应的蛋白分子相互结合，其中最常用的是用抗体检测，因此被称为免疫印迹。相对于DNA的SouthernBlot和RNA的NorthernBlot，蛋白质印迹被称为WesternBlot。2、基本过程：(1)电泳（Electrophoresis）：一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。

蛋白质：SDS凝胶

蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体。目前进行的Western印迹反应大多还是从凝胶上直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素滤膜之上。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。

(2)转膜(Transfer)：印迹技术(3)封闭(Blocking)：

封闭可能结合非相关蛋白的位点以降低这类非特异性结合背景的效果。

(4)一抗孵育(Primaryantibodyincubation)：

特异性抗体（一抗）和转移膜上相应的蛋白分子结合.(5)二抗孵育

(Secondaryantibodyincubation)：

碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)或放射性核素标记的二抗与之反应。二抗需根据一抗进行选择。(6)显色：

用放射自显影或底物显色检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度.蛋白质印迹杂交实验——Westernblotting放射自显影照片3、应用：（1）检测样品中特异蛋白质的存在（2）细胞中特异蛋白质的半定量分析（3）蛋白质分子的相互作用研究三种印迹技术的比较第二节

PCR技术的原理与应用PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,扩增DNA的设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis（1944－）“Idomybestthinkingwhiledriving”1993Nobelprize

一、概念：PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链反应:

在体外对目的DNA进行大量扩增的技术，当目的DNA加热变性时，使其成为单链，与一对特异性引物在退火时进行杂交，在耐热的DNA聚合酶作用下进行反应，并循环进行几十次，使目的DNA得到大量的扩增。(其基本理论建立在DNA变性、复性及分子杂交的基础之上。)PCR特点1.高度敏感性2.高度特异性3.高产率4.可重复、操作简单

二、PCR的基本原理1、PCR反应体系模板DNA

特异引物底物dNTP

耐热性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）

Mg2+缓冲液threesteps:HowPCRworksDenaturation

(变性):90～97℃Annealing

(退火):45～55℃Extension

(延伸):

around

72℃2、基本反应步骤：变性（denature）：将反应体系加热至90-97℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep1:Denaturation

变性94℃

退火（annealing）：当温度突然降低至45-65℃,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链。TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep2:Annealing

退火T

℃

primer-dependent

CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAG延伸(extension):将温度升高至70-74℃下，在TaqDNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下引物沿着模板DNA延伸。TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep3:Extension

延伸72℃CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATCGCGATATTACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA

以上三个步骤构成一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30）次即可达到扩增DNA片段的目的。聚合酶链式反应1.Denaturation2.

Annealing3.

ExtensionPCR.EXE5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA55555555Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。二、PCR技术的主要用途

（一）目的基因的克隆可以利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段（二）基因的体外突变

利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。（三）DNA和RNA的微量分析

PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。

（四）DNA序列测定将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。（五）基因突变分析

PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。三、几种重要的PCR衍生技术（一）逆转录PCR技术反转录PCR（reversetranscriptionRT-PCR）：以RNA为起始模板产生cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。

cDNAcomplementaryDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。

（二）原位PCR技术

原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。（三）实时