章核酸的理化性质研究方法详解演示文稿

章核酸的理化性质研究方法详解演示文稿当前1页，总共23页。（优选）章核酸的理化性质研究方法当前2页，总共23页。核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；磷酸基和碱基：酸碱性质；碱基：紫外吸收特性；双螺旋结构：变性和复性。当前3页，总共23页。一、核酸的水解（一）酸水解糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱（二）碱水解RNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2’-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2’，3’-环磷酸酯，继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸）当前4页，总共23页。（三）酶水解专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶(nuclease)。能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。

当前5页，总共23页。1、核酸酶的分类（1）按底物专一性分类：核糖核酸酶（ribonuclease,RNase）：作用于核糖核酸；脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）：作用于脱氧核糖核酸；（2）按底物作用的方式分类：核酸外切酶（endonuclease）：从多核苷酸链的末端开始,逐个将核苷酸切下的酶；核酸内切酶(exonuclease)：从多核苷酸链的内部开始水解核酸的酶。当前6页，总共23页。（3）按磷酸二酯键断裂的方式分类：一种是在3’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；另一种是在5’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。PPPNNN(1)(2)(1)(2)5’3’当前7页，总共23页。2、核糖核酸酶类牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等；3、脱氧核糖核酸酶类牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶等。4、N－糖苷酶当前8页，总共23页。核酸酶底物切点产物胰核糖核酸酶RNA内切核酸酶嘧啶3’端，留下3’－P3’嘧啶单核苷酸或3’-嘧啶核苷酸结尾的寡聚核苷酸蛇毒磷酸二酯酶RNA，DNA外切核酸酶3’端，留下3’－OH5’－单核苷酸牛脾磷酸二酯酶RNA，DNA外切核酸酶5’端，留下5’－OH3’－单核苷酸大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ单链DNA外切核酸酶5’端，留下5’－OH3’－单核苷酸及一个末尾二核苷酸大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ双链DNA外切核酸酶3’端，留下3’－OH5’－单核苷酸当前9页，总共23页。当前10页，总共23页。二、核酸的酸碱性质1、碱基的解离C的N3有一对未共用电子，可与质子结合；C的烯醇式羟基具有释放质子的能力；U的N3酸性解离的pK1’=9.5;T的N3酸性解离的pK1’=9.9;A的N1pK1’=4.15G的N7pK1’=3.2

N1pK2’=9.6；N9pK3’=12.4当前11页，总共23页。2、核苷的解离戊糖的存在增强了碱基的酸性解离：A的N1pK1’由4.15降为3.63；C的pK1’由4.6降为4.15；当前12页，总共23页。3、核苷酸的解离HpK1’＝1.5当前13页，总共23页。核苷酸有磷酸与碱基，为两性电介质；U的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子；A,G,C中，pK1’：第一磷酸基-PO3H2的解离；pK2’：含氮环＝N+H-的解离；pK3’：第二磷酸基-PO3H-的解离；故其pI＝（pK1’

+pK2’）／2DNA变性双链打开后，碱基即参与酸碱滴定。

当前14页，总共23页。三、核酸的紫外吸收Py和Pu有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm。不同核苷酸当前15页，总共23页。A260＝εCL公式中，A260为光密度

ε，为260nm处的碱苦摩尔消光系数

C，为每升溶液中碱基的摩尔数

L，为比色杯内径的厚度如：已知鸟嘌呤溶液的A260＝0.325，

ε＝7.2X103，L＝1cm，则：C＝0.325/(7.2X103X1)＝4.5X10-5（mol/l）紫外光区最大吸收：260nm，定性定量分析当前16页，总共23页。第五节DNA的理化性质及其应用一、核酸的一般理化性质核酸具有酸性；粘度大；当前17页，总共23页。二、DNA的变性

在理化因素作用下，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为DNA的变性(denaturation)

。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。

当前18页，总共23页。①增色效应：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象；②旋光性下降；③粘度降低；④生物学功能丧失或改变。引起DNA变性的因素主要有：①高温，②强酸、强碱，③有机溶剂等。DNA变性后的性质改变：

当前19页，总共23页。

DNA的变性温度：加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度（融解温度，Tm）。当前20页，总共23页。

Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。Tm＝69.3+0.41(％G＋C)12nd当前21页，总共23页。三、DNA的复性与分子杂交将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温