发酵工业菌种

发酵工业菌种第1页/共133页工业微生物的要求能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；

生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；第2页/共133页菌种选择的要求（续）菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素；第3页/共133页２.１菌种的分离筛选一、菌种的来源根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；经济性指导性第4页/共133页从已知菌种和大自然中分离新菌株寻找新的发酵产品的产生菌；寻找老产品的新的优良菌株。

第5页/共133页二、分离思路菌种的分离是从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。第6页/共133页

1.菌种选择的总趋势野生菌→变异菌自然选育→代谢控制育种诱发基因突变→基因重组的定向育种

第7页/共133页2.筛选的两种指导思想

先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。结果有两种可能：获得适于工业发酵菌株只获得选育所需的出发菌株

第8页/共133页2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；

生产中长期使用的菌种的定期分离筛选；从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株；第9页/共133页设计筛选方案时必须考虑两个要点

选择性灵敏度

第10页/共133页新种分离与筛选的步骤定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。形态、营养要求、生理生化特性、发酵周期、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值等。第11页/共133页3.新种分离与筛选的步骤

调查研究（包括资料查阅）

试验方案设计

含微生物样品的采集（如何使样品中含所需微生物的可能性大？）

样品预处理（如何在后续的操作中使这种可能性实现）

菌种分离

第12页/共133页

根据目的菌株及其产物特点分

选择性分离方法 随机分离方法

(定向筛选←选择压力)

(用筛选方案-检测系统进行间接分离）

富集液体培养固体培养基条件培养

(初筛)

菌种纯化

复筛

第13页/共133页

菌种纯化初步工艺条件摸索再复筛生产性能测试较优菌株1-3株保藏及进一步做生产试验某些必要试验和或作为育种的出发菌株毒性试验等

第14页/共133页2.1.1样品的采集采样时应注意的问题:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情况采样季节土壤的酸碱度对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：土壤来源广泛在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种第15页/共133页（二）采样方法用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5~25cm处的土样10~25g装入事先准备好的塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。第16页/共133页样品的预处理目的：提高分离效率方法：物理方法：热处理；膜过滤法；离心法化学方法诱饵法第17页/共133页分离方法的选择

根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特

生长特征独特

无选择性特征根据产物的特征进行

随机分离选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。选择性分离

第18页/共133页2.1.3样品的富集培养富集培养是根据目的微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利于目的微生物生长的条件，使目的微生物迅速地生长繁殖，数量增加，由原来的劣势种变为优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养要根据微生物的碳、氮源、PH、温度、需氧等生理因素加以控制。第19页/共133页

选择性分离原理和技术生长条件的选择与控制原理控制营养成分

控制培养基酸碱度

添加抑制剂

控制培养温度

控制通气条件

选择性分离技术富集液体培养技术固体培养技术施加选择压力，进行定向筛选

第20页/共133页A.富集液体培养增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件培养方式分批培养方式：以最大比生长速率（μmax）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（μ）筛选第21页/共133页

μ

ABS0基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响

当S<S0时，富集什么菌株？当S>S0时，富集什么菌株？第22页/共133页连续富集培养技术分离菌株的优点

分离的菌株特别适合连续发酵生产过程有利于分离具有某种工业生产特性的菌株可以筛选出能共生的稳定混合培养物

第23页/共133页B.固体培养技术常用于分离某些酶产生菌

选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质

第24页/共133页2.1.4、菌种的分离

(一)

稀释涂布法把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬浮液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。第25页/共133页1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释第26页/共133页1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法第27页/共133页(二)划线分离法

用接种环取部分样品或菌体，在某平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。第28页/共133页2.平皿划线分离法

a.连续划线分离法b.分区划线分离法第29页/共133页（三）利用平皿的生化反应进行分离

1透明圈法平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物在菌落周围产生透明圈，圈的大小一般与该菌株利用底物的能力有关。分离脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸水解酶产生菌时采用，产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。第30页/共133页在分离某种产生有机酸的菌株时，在培养基中加入碳酸钙，使平板成混浊状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以鉴别出来。第31页/共133页2．变色圈法

在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。筛选果胶酶的产生菌时，用含0.2％果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2％刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。第32页/共133页

筛选谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，变色范围在pH6.2—7.6，当pH在6.2以下时为黄色，PH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可筛选谷氨酸产生菌。第33页/共133页3．生长圈法生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。第34页/共133页只要是筛选微生物营养缺陷型产生菌,都可以采用生长圈法.工具菌采用相应的营养缺陷型菌株,由于得到所需的营养,凡是目的微生物都出出现浑浊的生长圈.第35页/共133页氨基酸产生菌的筛选

样品

预处理

初筛（除真菌）

在分离平板上生长获得多个单菌落复印平板（copy法）

平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸对应到copy前相应

u.v线杀死长好的菌落

位置，找到目的菌落

再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂

培养后

产氨基酸菌落周围有生长圈

目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定筛选产物含量高的菌株第36页/共133页4．抑菌圈法抑菌圈法是抗生素筛选常用的初筛方法.工具菌是抗生素的敏感菌。第37页/共133页若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，被鉴别出来。第38页/共133页抗生素产生菌的筛选筛选模型：试验菌筛选方法：铺菌法

复印平板法液体培养筛选

抗药性筛选筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同

I II无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性

固体培养筛选第39页/共133页2.1.5菌种的初筛和复筛

采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。第40页/共133页初筛是从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程。由于菌株多，工作量大，为了提高初筛的效率，通常需要设计一种快速、简便又较为准确的筛选方法。一、初筛第41页/共133页1.平板筛选通过该法可淘汰85％一90％不符合要求的微生物，剩下较好的菌株则需进行摇瓶复筛。在纯化分离阶段随机挑选的菌株，由于数量大，不能确定是否具有目的产物生产能力，只能首先采取较粗放的检测方法。第42页/共133页优点：琼脂平板定性测定法．简便、快速，在筛选上作量大时具有相当优越性。缺点：产物活性只能相对比较，难以得到确切的产量水平，只适用于初筛。在初筛时尽量使用这种平皿快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为肉眼可见的显色或生化反应，能较大提高筛选效率，减少工作量。第43页/共133页二、复筛复筛：一个菌株通常重复3—5瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定。优点：可信度大；缺点：操作繁琐，测定时间长，影响筛选工作量。第44页/共133页菌种选育改良的具体目标提高目标产物的产量提高目标产物的纯度，减少副产物改良菌种性状，改善发酵过程改变生物合成途径，以获得高产的新产品第45页/共133页目的

提高目标产物的能力

提高产品质量

开发新产品

解决生产实际问题

防止菌种退化2.2工业微生物育种第46页/共133页基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNAShuffling等方法第47页/共133页自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，称为回复突变问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？第48页/共133页自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验第49页/共133页二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍{第50页/共133页二、诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选第51页/共133页(一)出发菌株的选择1．野生型菌株，诱变处理较敏感；2．在生产中选种得到的菌株与野生型较相像的菌种；3．每次诱变处理都有一定提高的菌株；4．出发菌株开始时可以同时选2～3株；5．选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞；第52页/共133页

(二)处理菌悬液的制备制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水第53页/共133页(三)诱变处理

根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。第54页/共133页

(四)中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来,此过程称为中间培养.中间培养对筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。第55页/共133页

方法：

让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。

第56页/共133页(五)分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.

第57页/共133页①营养缺陷型的选育营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。第58页/共133页

①基本培养基（MM，minimalmedium）——仅能满足野生型菌株生长营养要求的培养基。②补充培养基（SM，supplementalmedium）——在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基。③完全培养基（CM，completemedium）——凡可满足一切营养缺陷型菌株需要的天然或半组合培养基。与筛选营养缺陷型有关的三类培养基第59页/共133页筛选营养缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱第60页/共133页淘汰野生型抗生素法：由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，在MM中一定量的抗生素，杀死活化状态的野生型，保存了休眠状态的缺陷型细菌－青霉素，酵母－制霉菌素菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过第61页/共133页检出缺陷型原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。

具体方法：影印法、点种法、夹层法第62页/共133页生长谱测定的方法将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5-6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。一个平皿测一个菌。第63页/共133页天冬氨酸黄色短杆菌的代谢过程甲硫氨酸苏氨酸赖氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸激酶天冬氨酸β－半醛抑制高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶(hom)第64页/共133页天冬氨酸激酶（AK），是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制

协同反馈抑制：该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。

黄色短杆菌的代谢特点第65页/共133页天冬氨酰磷酸天冬氨酸-β-半醛高丝氨酸高丝氨酸磷酸O-琥珀酸高丝氨酸二氢吡啶-2,6-二羧酸赖氨酸苏氨酸异亮氨酸蛋氨酸天冬氨酸12345第66页/共133页两个分支点的优先合成机制：优先合成Hos，然后再优先合成Met

当Met过量时阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶，使代谢流向合成Thr的方向进行当Thr过量时反馈抑制高丝氨酸脱氢酶，使代谢流向Lys的合成上。（Met＞Thr＞Lys）第67页/共133页

切断或减弱代谢支路

切断或减弱合成Met、Thr的分支途径——选育营养缺陷型或渗漏突变株育种途径第68页/共133页

优先合成的转换：可引起一种终产物的过量生成。高比活性的HD使Thr优先合成。若往培养基里添加过量的Met，将HD的活性控制在原来活性的1/3，在野生株中也能积累5g/LLys，进一步通过突变将HD比活性降低到原来活性的1/3，可积累20g/LLys。A、需要选用Hom-,其意义在于：第69页/共133页

结果：由于HD活性下降但不完全丧失，使代谢流发生变化，使原来优先合成Hos方向转向合成Lys方向。而Thr和Met少量合成，生成的Thr的量不足以与lys共同对AK酶起协同反馈抑制，就使Lys得以积累。第70页/共133页

解除了Hom的优先合成机制，阻断了代谢向Met、Thr的方向进行，节省了原料，可以使Asp-β-半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上。B、需要选用Hom-，其意义在于：第71页/共133页

在培养基中限量的供给Met、Thr（或者Hom），对于AK酶活性的调节有着重要意义。因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶，限制了其中某一个抑制物（Thr），则Lys的浓度再高，也不会影响到AK酶的活性，那么，代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行，使得产物的合成畅通无阻。第72页/共133页

双重营养缺陷型突变株（Met-+Thr-）,其本质和Hom-相同。优点：遗传性质稳定，回复突变的几率少。

第73页/共133页天冬氨酸人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸中间产物Ⅰ天冬氨酸激酶中间产物Ⅱ甲硫氨酸苏氨酸高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶不能合成可以大量积累赖氨酸人工诱变的菌种不能产生第74页/共133页从理论上讲，选育Hom-进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hom-是不够的。为了高效率的转化Lys，需要解决这一问题：是该酶（AK）脱敏（就是该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力），如何使其脱敏呢？解除反馈调节（—反馈阻抑）第75页/共133页结构类似物：结构与代谢产物类似的化合物特点：有反馈调节作用无正常生理功能筛选方法：浓度梯度法（补充）筛选结构类似物抗性突变株第76页/共133页选育结构类似物抗性突变株？（Xr）

S-L-半胱氨酸抗性突变株AECr（效果最佳，应用最广）γ-甲基赖氨酸抗性突变株MLrL-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株LysHxr

苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株ThrHxr第77页/共133页L-Lys:CH2(NH2)-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)COOHAEC:CH2(NH2)-CH2-S-CH2-CH(NH2)COOH结构类似物AEC物的作用机制：起假反馈抑制作用

AEC与L-Lys结构相似，被天冬氨酸激酶所误认，与Thr一起在天冬氨酸激酶的变构部位上结合，协同抑制酶活。抗结构类似物突变株的实质：天冬氨酸激酶编码的结构基因发生突变。第78页/共133页调节基因或操纵基因发生突变，产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因上，因此不能再起反馈阻遏作用；或是由于编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力但具有催化活性，从而解除了反馈抑制。第79页/共133页结构类似物与末端产物有相似的结构，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用，但它们不能代替末端产物参与生物合成，它们在细胞内浓度不会降低，因此他们与阻遏蛋白或变构酶结合也是不可逆的。未突变的细胞因代谢受阻，不能合成某种产物而死亡。抗反馈调节突变株则即使在结构类似物存在下，仍可合成末端产物形成菌落。第80页/共133页③组成型突变株的筛选结构基因或操纵基因发生突变，均可获得组成型突变株。组成型突变株的筛选设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生长的条件，造成组成型菌株生长优势，选出组成型突变菌株。β-半乳糖苷酶邻硝基-β-D-岩藻糖苷乳糖第81页/共133页赖氨酸生产菌种的选育改良思路出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌育种思路

1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育

2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型

3.抗结构类似物突变株的选育：AEC4.解除代谢互锁：Leu-、

抗Leu结构类似物、喹啉s

、苯醌s5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：

Ala-、抗Asp结构类似物

选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株

6.改善细胞膜的透过机能

7.选育温度敏感突变株

8.应用细胞工程和基因工程育种第82页/共133页第83页/共133页四原生质体融合技术把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹的球状物（称原生质体）.两亲本的原生质体在高渗条件互相混合，由聚乙二醇作为助溶剂，使它们互相凝集发生融合，两亲本基因组由接触到交换，实现遗传重组。第84页/共133页(一)杂交频率较高(二)受接合型或致育型的限制小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，有利于不同种属间微生物的杂交。(三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。一、原生质体融合育种的特点第85页/共133页第86页/共133页基因重组

甲

生长快、产量低乙生长慢、产量高生长快、产量高第87页/共133页

(四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。（五）有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。

(六)提高菌株产量的潜力较大。

(七)有助于建立工业微生物转化体系。第88页/共133页三、原生质体融合育种步骤1．标记菌株的筛选和稳定性验证2．原生质体制备3．等量原生质体加聚乙二醇促进融合4．涂布于再生培养基，再生出菌落5．选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。6．生产性能筛选第89页/共133页影响原生质体制备的因素1．菌体的前处理2．菌体的培养时间3.酶浓度

第90页/共133页4．酶处理温度5．破壁pH值6．渗透压稳定剂等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。第91页/共133页四、基因工程育种基因重组育种：是运用体外DNA各种操作获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒等载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达。第92页/共133页一个完整的基因克隆过程包括以下步骤１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外连接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。第93页/共133页第94页/共133页质粒载体第95页/共133页载体－宿主系统载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA；一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。第96页/共133页载体应具备以下条件：１、能在适当的宿主细胞中复制；２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。第97页/共133页宿主细胞必须符合以下条件１、对载体的复制和扩增没有严格的限制；２、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；３、在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；４、重组缺陷型，不会产生体内重组；５、容易导入重组DNA分子；６、符合重组DNA操作的安全标准。第98页/共133页目的基因的获取一、通过建立基因文库分离靶基因基因文库包括两类：基因组文库：利用限制性内切酶。cDNA：用mRNA反转录成单链DNA，再经DNA聚合酶的作用产生双链DNA,可去除真核生物基因中不表达的内含子。第99页/共133页二、化学合成法制备DNA片段从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照密码合成基因。三、聚合酶链反应法扩增基因片段对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。第100页/共133页DNA扩增PCR反应第101页/共133页DNA片段的体外连接是重组DNA技术的关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成的。DNA分子的体外连接第102页/共133页一、DNA连接酶DNA连接酶催化两条双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA连接酶。T4DNA连接酶在分子克隆中主要用于：１、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；２、连接双链DNA分子间的平端；３、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。第103页/共133页重组DNA导入宿主菌体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。第104页/共133页一、转化指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理处于感受态－即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。第105页/共133页二、转染和感染

利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌;一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。第106页/共133页重组克隆的筛选与鉴定

基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。第107页/共133页一、抗药性标志的筛选

如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetrr，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。第108页/共133页二、β－半乳糖苷酶系统筛选很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，而某些宿主细胞表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链。当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补。而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。第109页/共133页经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。三、菌落快速裂解鉴定法四、内切酶图谱鉴定第110页/共133页重组DNA的鉴定第111页/共133页2.3、工业微生物菌种保藏保藏原理：根据菌株生理生化特性，人工创造条件（低温、干燥、真空）使菌体的代谢活动休眠期状态。目的要求：经长期保藏后菌种存活健在，保证菌种不改变表型和基因型，特别是不改变菌种代谢产物生产能力注意事项：要保藏休眠体；培养基异贫乏，碳源少；尽量减少对细胞的损伤第112页/共133页⑴

冷冻保藏

冷冻保藏（-20℃以下）：将菌种加入菌种保护剂（甘油或二甲基亚砜）通过冷冻，使微生物代谢活动停止。冷冻温度愈低，效果愈好。同时要掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻保藏的缺点运输较困难。主要冷冻保藏方法普通冷冻保藏技术(-20℃)超低温冷冻保藏技术(-60－-80℃)液氮冷冻保藏技术（-130－-150℃）第113页/共133页保藏方法：将菌悬液或斜面培养物细胞将菌种加入菌种保护剂，密封于试管或EP管内，贮藏于冰箱的冷藏室或普通冰箱(-20℃)中。保藏期限：1—2年注意事项：经次解冻的菌株不宜二次保藏；保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封；不适宜多数微生物的长期保藏。①普通冷冻保藏技术(-20℃)第114页/共133页保藏方法：取对数生长中期至后期的微生物细胞，用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞，加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜，混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-60℃超低温冰箱中保藏。保藏期限：5年注意事项：冷冻速度控制在1-2℃／min②

超低温冷冻保藏技术(-60－-80℃)第115页/共133页

③液氮冷冻保藏技术保藏方法：斜面用10％甘油制备悬液或培养液体物用20%甘油制备悬液，混匀，取0.5～lmL分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，酒精喷灯封口；先于5℃冰箱中3min，后置于金属容器，以1-2℃/min控速冷冻至细胞冻结点(通常为-30℃)，再以1℃/min控速冷冻至-50℃；迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存。第116页/共133页复苏方法：从液氮罐中取出所需的安瓿，立即冰浴10min；再迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，轻摇融解；取0.1-0.2ml转接入琼脂斜面上。保藏期限：10年以上注意事项：保护剂最终浓度为10％无菌甘油或5％无菌二甲亚砜。甘油为高压蒸汽灭菌，二甲亚砜最好为过滤灭菌。第117页/共133页⑵

冻干保藏

保藏方法：将混有保护剂冰冻至-60℃菌种迅速转移至-40℃时启动真空泵，使真空度减压到2.67～4.00Pa条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使菌种干燥成粉，分装密封安瓿，低于5℃下保藏。是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。保藏期限：10年以上注意事项：冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，如脱脂乳和蔗糖，冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。第118页/共133页⑶

其他保藏方法①传代保藏②矿物油中浸没保藏

第119页/共133页①传代保藏保藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂斜面基本培养基上传代，5℃以下保藏保藏期限：

1-3月注意事项：此法简单和经济，可用于实验室中若干菌种的保藏；但易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变，应加以防治。不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。第120页/共133页保藏方法：将琼脂斜面或液体培养菌种物浸入无菌矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。保藏期限：

1-3年注意事项：以液体石蜡保藏时，应对菌株预先作石蜡培养试验，保藏株2～3年也应做一次存活试验。②矿物油中浸没保藏第121页/共133页⑷

基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。当培养基中加入抗生素时，有利于携带质粒的细胞群体生长选择压力，有利于维持质粒复制与染色体复制的协调，基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。第122页/共133页⑸

微生物活力和稳定性测定目的要求：保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状