高效液相色谱仪的使用

关于高效液相色谱仪的使用第1页，共56页，2023年，2月20日，星期日一、概述色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年提出。分离出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素。因一战爆发并未重视。第2页，共56页，2023年，2月20日，星期日色谱柱固定相流动相色谱法第3页，共56页，2023年，2月20日，星期日色谱的发展20世纪70年代高效液相色谱出现1906色谱法发明20世纪50年代气相色谱出现并广泛使用19世纪中叶人们开始注意一些简单的扩散现象染料目前HPLC已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段第4页，共56页，2023年，2月20日，星期日色谱的类型气相色谱：流动相是气相液相色谱：流动相是液相色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC气相色谱第5页，共56页，2023年，2月20日，星期日1.HPLC与经典LC

HPLC比起经典LC的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。经典色谱是重力加料，流出速度极慢，流动相速度为30ml·h-1，需用20h才能分离出20种氨基酸；而HPLC配备了高压输液设备，流速最高可达10ml·min-1，只需lh之内即可完成氨基酸的分离。第6页，共56页，2023年，2月20日，星期日高效：固定相具有分离效果好、效率高，如用C18柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。高灵敏度：高灵敏度检测器，可检测μM级甚至nM级别的待测物。高自动化：操作自动化，可仪器控制流动相比例、流速、波长、出峰时间、进样及自动生成分析报告等。第7页，共56页，2023年，2月20日，星期日2.HPLC与GC（l）气相色谱法(GC)分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用HPLC进行分离和分析。（2)GC中流动相是惰性气体，它与组分没有亲和力，仅起运载作用。而HPLC中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用。（3）GC一般都在较高温度下进行的，而HPLC可在室温条件下工作。第8页，共56页，2023年，2月20日，星期日HPLC应用（1）生命化学：蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、酶、维生素等物质的分离和测定；（2）化学与精细化工：植物色素、高聚物、染料、化工产品、合成化合物等的分离和分析；无机离子的测定等；（3）农业、食品与医药学：添加剂（甜味剂、防腐剂、着色剂）、营养成分（蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸等）、药物体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物、农药残留等；（4）环境分析与毒理学：多环芳烃及农药残留、DNA加合物分析。优点是灵敏度高，分离效果好；缺点是仪器设备费用昂贵，需摸索分析方法，操作严格，这是它的主要缺点。

第9页，共56页，2023年，2月20日，星期日二、液液色谱法的分类液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为：正相色谱法反相色谱法第10页，共56页，2023年，2月20日，星期日正相色谱法固定相极性大于流动相。采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷)，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。第11页，共56页，2023年，2月20日，星期日反相色谱法固定相极性小于流动相。一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。它在液相色谱中应用最为广泛，占整个HPLC应用的80%左右。C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。第12页，共56页，2023年，2月20日，星期日三、色谱法的分离原理分离原理样本组分进样到色谱柱上时，会与固定相发生作用，包括吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用。当流动相洗脱色谱柱时，由于各组分与固定相作用的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，和固定相结合弱的组分先出来，结合强的后出来，不同组分会先后从固定相中流出，一个物质会形成一个色谱峰。色谱法由于能分离许多物质，被称为分离的巨人。第13页，共56页，2023年，2月20日，星期日第14页，共56页，2023年，2月20日，星期日色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。←色谱峰保留时间（分）基线↓峰高峰宽响应值第15页，共56页，2023年，2月20日，星期日基本术语色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线。基线(baseline)——在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线。噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。第16页，共56页，2023年，2月20日，星期日漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线。不对称色谱峰有两种：前延峰和拖尾峰。前者少见，可能是柱子出问题。第17页，共56页，2023年，2月20日，星期日保留时间(retentiontime，tR)——组分从进样到出现峰最大值所需的时间。理论塔板数(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。

当色谱柱长度一定时，塔板数N越大，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能越高，所得色谱峰越窄。第18页，共56页，2023年，2月20日，星期日峰高(peakheight，h)—峰的最高点至峰底的距离。峰面积(peakarea，A)—峰与峰底之间的面积,又称响应值。精密度—日间、日内精密度准确度—加标回收率值为（加标样的量－样品量）×100%

标品的量标准曲线第19页，共56页，2023年，2月20日，星期日定性定量分析及色谱图标准品-保留时间9.3min标准物质确定物质保留时间定性第20页，共56页，2023年，2月20日，星期日色谱法定性定量分析1.根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析。2.根据色谱峰的面积或峰高,可以进行定量分析。3.实验过程（1）确定实验条件（流动相、流速、检测波长等）。（2）溶液的配制：流动相、标准品和待测样品。（3）精密度和准确度实验。（4）标准曲线测定。（5）样品测定。第21页，共56页，2023年，2月20日，星期日色谱分析用水（1）专门的超纯水机,得到Milli-Q水；（2）去离子水重蒸；（3）二次或三次重蒸水；（4）采用类似家用的纯水机；（5）市场上瓶装的纯净水或蒸馏水。不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水。理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22μm的滤膜，除去有机物、无机离子及空气等。第22页，共56页，2023年，2月20日，星期日HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温箱等。目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京普析分析仪器厂等。四、仪器组成第23页，共56页，2023年，2月20日，星期日数据分析系统输液系统进样系统分离系统检测系统HPLC的系统组成数据处理系统第24页，共56页，2023年，2月20日，星期日岛津公司LC-20第25页，共56页，2023年，2月20日，星期日Agilent公司

1200LC第26页，共56页，2023年，2月20日，星期日

为什么要用高压输液系统？由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。一元、二元、四元泵。HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。1.输液泵

第27页，共56页，2023年，2月20日，星期日输液泵的主要性能①流速稳定：如1ml/min,其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流速量范围宽：分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min；③输出压力高：一般应能达到25MPa或400巴;④密封性能好，耐腐蚀。第28页，共56页，2023年，2月20日，星期日泵的保养使用流动相尽量要清洁，尽量带进避免颗粒物质，造成泵内堵塞；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下，以免产生结晶；泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液；输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液；流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。第29页，共56页，2023年，2月20日，星期日2.进样器2种方法：（1）一般常用六通进样阀。可用微量注射器或定量环进样。前者要求每次进样体积准确、相同。后者进样量应大于定量环体积的3~6倍，这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。（2）自动进样用于大量样品的常规分析。

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六通阀进样演示第31页，共56页，2023年，2月20日，星期日3.色谱柱担负分离作用，是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子。一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。第32页，共56页，2023年，2月20日，星期日色谱柱由柱管、柱接头、筛板（滤片）、堵头和螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。常规分析的色谱柱有内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10~30cm。

第33页，共56页，2023年，2月20日，星期日色谱柱使用注意事项柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；第34页，共56页，2023年，2月20日，星期日进样样品要提纯，避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理；在色谱柱前加预柱或保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱，可以起到保护、延长柱寿命的作用，可更换。每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用清洗柱；第35页，共56页，2023年，2月20日，星期日若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂如甲醇保存，拧紧柱接头，防止溶剂挥发干燥。新柱不用是可放时间长些。柱压升高的原因有样品和流动相有杂质或颗粒、缓冲液盐结晶使柱子堵塞、体系不平衡等。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。第36页，共56页，2023年，2月20日，星期日溶剂和样品过滤对色谱柱、仪器起到保护作用。对色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。对仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。第37页，共56页，2023年，2月20日，星期日4.检测器检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。检测器的类型有紫外可见光、荧光、电化学、电导、放射性检测器等。第38页，共56页，2023年，2月20日，星期日性能指标

（1）噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。（2）灵敏度：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。（3）检测限（LOD）：试样中被测物能被检测到的最低量，以信噪比接近为3:1时的相应浓度作为检测限。以信噪比接近为10:1时的相应浓度作为定量限（LOQ）第39页，共56页，2023年，2月20日，星期日（4）线性范围：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围。检测器所产生的信号与被测样品的量呈一定的函数关系作为依据。线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些。

第40页，共56页，2023年，2月20日，星期日5.色谱工作站色谱工作站主要有电脑、信号记录系统和分析软件。不同的色谱工作站在处理数据时情况不同，但目前大多是记录仪记录检测信号，使用积分仪计算峰高、峰面积和保留时间等参数。好的工作站除能采集、处理和分析数据外，还能控制仪器操作，对色谱系统进行优化。第41页，共56页，2023年，2月20日，星期日6.柱温箱色谱柱和检测器都要求能准确地控制工作环境温度，恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间。温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般来说，温度升高，可提高溶质在流动相中的溶解度，从而降低其分配系数，但对分离选择性影响不大；还可使流动相的粘度降低，从而改善传质过程并降低柱压。但温度太高易使流动相产生气泡。

温度对保留时间有影响。要根据色谱柱说明书上要求的最适宜温度设置柱温箱的温度。第42页，共56页，2023年，2月20日，星期日7.超声脱气流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起猝灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。一般流动相溶液需超声20~30min。这种离线脱气不能维持溶剂的脱气状态，在停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中，在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。在线（系统内）脱气法无此缺点。第43页，共56页，2023年，2月20日，星期日8.灯的保养荧光分析用的是氙灯，5000元左右，寿命在800小时左右。因此在色谱柱平衡得差不多、要开始分析时，再打开检测器荧光灯；在分析完成后，马上关闭氙灯。第44页，共56页，2023年，2月20日，星期日五、仪器分析过程与操作1.流动相的贮存：

一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染，造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。第45页，共56页，2023年，2月20日，星期日2.流动相比例调整：

按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜。所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。流动相组成、pH、比例摸好后，即按此条件测定样品。流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。第46页，共56页，2023年，2月20日，星期日3．样品配制：玻璃容器必须洗净，酸泡处理后使用，尽量少用或不用塑料容器。HPLC应用中要求用超纯水或纯净水或三蒸水配置样品。样品配制应严格按照方法要求的步骤进行。样品配制同时还需配制标准样品，用于标准曲线的测定和目的峰的确定。第47页，共56页，2023年，2月20日，星期日4.记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如50min-60min），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。第48页，共56页，2023年，2月20日，星期日5.进样量：应注意进样量要准确、一致。20微升或10微升可由预实验或标准方法确定。

6.确定目的峰的保留时间。7.绘制标准曲线。8.测定精密度和准确度。9.样品测定。10.分析数据。第49页，共56页，2023年，2月20日，星期日Agilent1200LC操作步骤开机及分析（1）把流动相放入溶剂瓶中，用超声波脱气20min，放置20-30min后使用。（2）打开1200LC脱气装置、泵、检测器及工作站电源。（3）打开电脑,进入在线分析系统。（4）打开控制异丙醇流速的阀，用注射器抽气，直到液体流出，控制流速。第50页，共56页，2023年，2月20日，星期日（5）排气：打开“Purge”阀(往左扭松)，点击“泵”图标，点击“设置泵”选项，设置流速1m