分子生物学开题报告

经典word整理文档，仅参考，双击此处可删除页眉页脚。本资料属于网络整理，如有侵权，请联系删除，谢谢！分子生物学作业开题报告::::::::::::精选文库32P同位素敷贴对皮肤早期损伤一、（一）研究意义：32P同位素敷贴治疗是一种短距离放射治疗，由于其作用部位局限，放射剂量较小，制作简易使用方便，目前在临床被广泛地应用各种皮肤疾病，如血管瘤、跖疣、瘢痕疙瘩等，并取得了很好的疗效。目前关于PP敷贴对小儿血管瘤的治疗）3232的报道文献一致认为，P同位素敷贴作用于局部，放射剂量小，治32疗副作用很小，近期的副反应很轻。但是这些报道都是基于近期[1]的临床观察，而对于小剂量以及皮肤局部使用P同位素是否会引起32机体的损伤，尚缺乏实验依据。放射线是一种明确的致癌因素。尽管P同位素敷贴治疗剂量小，32P同位素敷贴治疗，仍可能具有潜在的不安全32性。此外，根据目前在全世界范围内作为辐射防护指导LNT（Linearno-threshold）假说不管有多低都有致癌潜能，换[2]句话说,辐射对机体没有安全阈值。越来越多的证据还表明，婴幼儿及儿童对放射引发癌症的易感性比成人高，早年的（婴幼儿、儿童及青少年时期）放射治疗或影像学诊断也会增加日后癌症发生的风险[3,。4]--2精选文库因此，P同位素敷贴治疗，尤其是在特定人群（婴幼儿或儿童32等）及一些能够找到替代治疗的疾病（如婴幼儿血管瘤）中，是否会因放射产生早期损伤以及远期效应遗传毒性，甚至致癌性)，急需要去阐明。（二）同类研究工作国内外研究现状与存在问题及立论依据32P同位素发射纯0.695MeV平均射程为体内外实验及临床用药表明，P同位素可以引起[5]32机体的损伤，也可以引起机体癌症发生，其中，P同位素所引起[6]32皮肤的癌症也有报道。此外，更加值得观注的是，流行病学表明，[7]幼年时使用放射性同位素治疗皮肤血管瘤会大大增加日后发生肿瘤[4,8]HaddyN所报道的幼年时使用放射性同位素治疗皮肤血管瘤会大大增加日后乳腺癌、甲状腺癌，KarlssonP也报道了颅内肿[9]瘤与幼年时使用放射性同位素治疗皮肤血管瘤明显相关[10]，以及BennettRG所报道的血管肉瘤等等但是P同位素敷贴治疗，是[11]32。否会引起皮肤组织损伤，尤其是对于特定的人群（如婴幼儿）是否引起远期损伤，甚至是否引起癌变或遗传毒性，尚缺乏实验依据。众所周知，机体暴露于电离辐射时，能引起广泛的DNA多部位DNA核苷酸碱基的损伤，DNADNAdouble-strandbreaks，DSBs)，以及DNA和DNA或DNA和蛋白的桥连等。DNADNA损伤或无法修复的DNADNA的损伤是属于组织早期损伤的范畴，DNA损伤也可以作为机--3精选文库体早期损伤的一个依据。机体在应对辐射所致的DNA损伤时，会启动一系列的保护机制，如细胞周期检查、DNA修复机制等。ATM在DNADSBs时，被招募至DNA损伤部位）并被激活，启动细胞周期检查及DNA修复ATMCHK2、[12]H2AX以及重要的p53.H2AX被磷酸化后称为γH2AX，能够招募与CHK2/P53DNA修复相关的BRAC1等至DNA损伤灶。体外实验也表明，P同位素能够引起ATM[13]32信号路的激活，引起ATM/γH2AX的高表达。因此，可以通过检测ATM、γH2AX，来直接反映DNA的损伤（尤其是双链DNA损伤或DNADSBs诱导DNA-PK高表达，DNA-PK是参与DNA修复的重要的酶。[14]因此，通过检测，可以间接反映DNA双链损伤。与致癌风险关系，还没有明确的定论，但是细胞DNA是放射生物学效应重要的作用位点，却是为大家所公认的。目前的理论认为,碱基尤其是胸腺嘧啶的损伤容易导致突变。未被修复或错误修复的DNA损伤，将会引起复制错误，甚至突变。DSBs的错误修复是引发的染色体畸变及基因突变最重要的因素。尽管DSBs能够通过同源重[15]组的方法被完好修复但是电离辐射所引DSBs绝大多数都是通过异non-homologousendjoining）修复的，而这种修复过程易于出错。因此，辐射导致的DNA损伤具有较高的突变潜能。[16]--4精选文库此外，非致命性的DNA损伤未被修复，会被传至子代细胞累积。电离辐射会增加DNA的损伤，对于未修DNA损伤的尤其是对快速分DNADSBs也会增加染色体重排的产生，引起杂合性缺失可能，从而引起某些抑癌基因的失活,诱导癌症发生。由此可见，机体DNA的损伤所引起基因突变是导致机体发[17]DNADNADSBs因素。基于以上论述，探索放射性引起机体DNADSBs损伤及染色质畸变甚至是基因突变，显然对探索P同位素敷贴治疗的早期损伤以32及远期副作用（致癌性）具有重要的意义。参考文献1.2.魏敬军,王育敏,王嘉军等.32P治疗体表血管瘤的疗效观察.中华皮肤科杂志.2003;36(12):685-686.EvaluationoftheLinear-NonthresholdDose-ResponseModelforIonizingRadiation(NCRPReportNo136).JournalofRadiologicalProtection.2002;22(3):331-335.3.KuhnsLR,OliverWJ,ChristodoulouE,GoodsittMM.Thepredictedincreasedcancerriskassociatedwithasinglecomputedtomographyexaminationforcalculusdetectioninpediatricpatientscomparedwiththenaturalcancerincidence.PediatrEmergCare.2011Apr;27(4):345-50.LindbergS,KarlssonP,ArvidssonB,HolmbergE,LunbergLM,WallgrenA.Cancerincidenceafterradiotherapyforskinhaemangiomaduringinfancy.ActaOncol.1995;34(6):735-40.4.5.WhiteJS,YueN,HuJ,BakkenistCJ.TheATMkinasesignalinginducedbythelow-energy-particlesemittedby(33)Pisessentialforthesuppressionof--5精选文库chromosomeaberrationsandisgreaterthanthatinducedbytheenergeticβ-particlesemittedby(32)P.MutatRes.2011Mar15;708(1-2):28-36.AcaroğluRE,GögüsT,ErcanMT,SungurA.Experimentalinductionofosteosarcomabysubperiostealradioactivephosphorusinjectionsinrats.NuclMedBiol.1995Feb;22(2):231-.UbiosAM,SilbermanFS,CabriniRL.Radioactive-inducedtumorsbyphosphorus-32ascolloidalcompound.Cancer.1983May1;51(9):1605-9.DondondeVathaireF,ShamsaldinA,DoyonF,DialloI,LigotL,PaolettiC,LabbéM,AbbasM,ChavaudraJ,AvrilMF,FraguP,EschwègeF.Cancermortalityafterradiotherapyforaskinhemangiomaduringchildhood.RadiotherOncol.2004Jul;72(1):87-93.9.HaddyN,DondonPaolettiC,RubinoC,MousannifA,ShamsaldinA,DoyonF,LabbéM,RobertC,AvrilMF,DemarsR,MolinieF,LefkopoulosD,DialloI,deVathaireF.Breastcancerfollowingradiotherapyforahemangiomaduringchildhood.CancerCausesControl.2010Nov;21(11):1807-16.Epub2010Jul5.KarlssonP,HolmbergE,LundbergLM,NordborgC,WallgrenA.Intracranialtumorsafterradiumtreatmentforskinhemangiomaduringinfancy--acohortandcase-controlstudy.RadiatRes.1997Aug;148(2):161-7.BennettKellerJW,DittyJFJr.Hemangiosarcomasubsequenttoradiotherapyforahemangiomaininfancy.JDermatolSurgOncol.1978Nov;4(11):881-3.TichýA,VávrováJ,PejchalJ,RezácováM.Ataxia-telangiectasiamutatedkinase(ATM)asacentralregulatorofradiation-inducedDNAdamageresponse.ActaMedica(HradecKralove).2010;53(1):13-7.PaullTT,RogakouEP,YamazakiKirchgessnerCU,GellertM,BonnerWM.AcriticalroleforhistoneH2AXinrecruitmentofrepairfactorstonuclearfociafterDNAdamage.CurrBiol.2000Jul27-Aug10;10(15):886-95.AndersonJA,HarperJV,CucinottaFA,O'NeillP.ParticipationofDNA-PKcsinDSBrepairafterexposuretohigh-andlow-LETradiation.RadiatRes.2010Aug;174(2):195-205.GoodheadDT.Initialeventsinthecellulareffectsofionizingradiations:clustereddamageinDNA.IntJRadiatBiol.1994Jan;65(1):7-17.LittleJB.Radiationcarcinogenesis.Carcinogenesis.2000Mar;21(3):397-404.BordeianuZugun-EloaeF,RusuroleofDNArepairbyhomologousrecombinationinoncogenesis.RevMedChirSocMedNatIasi.2011Oct-Dec;115(4):1189-94.16.17.--6精选文库二，研究内容、研究目标和拟解决的关键问题：（一）研究内容：本课题从P同位素敷贴治疗对SD幼鼠皮肤遗传物质的影响进行32DNADSBs损伤及染色质畸变甚至是基因突变）的实验依据。分如下几方面的内容：1.32P同位素敷贴治疗模型的建立：建立同位素敷贴的SD幼鼠治疗模型。2.P同位素敷贴对SD幼鼠皮肤DNA的作用：32（1）从总体水平用慧星实验初步检测SD幼鼠皮肤组织细胞有无DNA损伤。（2）P同位素敷贴对SD幼鼠皮肤组织细胞DNA双链损伤指32标ATMγH2AX影响：从转录及蛋白水平检测32P同位素敷贴是否引起SD幼鼠皮肤组织细胞ATMγH2AX表达水平升高。（3）P同位素敷贴对SD幼鼠皮肤组织细胞DNA双链损伤修32复指标DNA-PKP同位素敷贴是否32引起SD幼鼠皮肤组织细胞DNA-PK表达水平的升高。3.P同位素敷贴对SD幼鼠皮肤染色质（或染色体）影响32检测P同位素敷贴对SD32畸变，检测潜在的致突变性（二）研究究目标：通过对P同位素敷贴对皮肤的遗传物质的影响的检测，研究P3232同位素敷贴是否引起皮肤组织、染色体（质）的损伤及潜在的突变，初步评估P同位素敷贴治疗的安全性从以及在婴幼儿血管瘤32--7精选文库中应用的最终效益。（三）拟解决的关键问题：（1）P同位素敷贴是否引起SD幼鼠皮肤遗传物质的损伤？32（western-Blot检测ATMγH2AXDNA-PK蛋白的表达水平及染色体制备及鼠的染色体观察。三拟采取的研究方法、步骤、技术路线及可行性分析：、（一）研究方法：1.慧星实验：总体上检测DNA损伤慧星扫尾的现象。2.RT-PCR：用于从转录水平检测ATMγH2AXDNA-PKmRNA的表达。3.western-Blot：用于蛋白水平检测ATM、γH2AX、DNA-PK蛋白的表达。4.形态学观察：观察染色体是否有形态学改变。5.微核实验（themicronucleus传毒性（致突变性）6．数据统计：所有实验数据用SPSS14.0软件，用单因素方差分析或卡方检验方法进行统计，P≤0.05为差异有统计学意义。（二）步骤1.P同位素敷贴治疗模型的建立：32选SD幼鼠（1-2周）40只，随机分成四组，参考临床使用P同32位素敷贴的方法及剂量（紧密贴敷并固定于皮肤表面，采用每敷贴10μCi，贴敷30μCi5μCi10μCi20μCi剂量，均贴敷满72小时后，处死动物，采外周血（或骨髓）分别取敷贴处组织。每组5只鼠取部分组织，快速冻于液氮，每组的另外5只，取新鲜组织用于慧星实验及染色体制备。2.检测P同位素敷贴对SD幼鼠皮肤DNA的作用：32--8精选文库（1）从总体水平用慧星实验初步检测SD幼鼠皮肤组织细胞有无DNA损伤。方法参考文献，暂设计如下：a)取100mg皮肤组织，剔除结缔组织后放置于冰块上的培养皿内,PBS冲洗两次,眼科剪剪碎,加入0.25%胰酶4~5ml后,将培养皿放入37度温箱内消化30分钟。b)取出培养皿,加入10%的小牛血清4-5ml终止消化,再将已消化的皮肤细胞悬液倾入垫有4层纱布的玻璃漏斗,滤入15ml的离心管内。c)将所得滤液用PBS清洗后，将细胞制成悬液，并细胞计数，调整浓度为110个细胞/ml1mlPBS再清洗，71000rpm,离心10分钟,弃上清液。迅速注入37度的0.7%LMPAPBS溶液200μL,混匀,制备成细胞悬液,立即进行细胞核DNA损伤检测。对照组采取相同处理。d)DNA损伤检测按慧星实验试剂说明进行实验操作。（RT-PCR法检测P同位素敷贴对SD幼鼠皮肤组织细胞ATM、32γH2AXDNA-PK的mRNARNA及RT-PCR均按检测试剂说明书进行实验操作。（3）用Western-bolt方法检测P同位素敷贴对SD幼鼠皮肤组织细32胞ATM、γH2AXDNA-PK蛋白表达水平的的影响：提取总蛋白及Western-bolt实验均按检测试剂说明书操作。3.检测32P同位素敷贴对SD幼鼠染色体的影响：（1）皮肤组织染色体制备及形