分析基因工程菌生产抗菌肽的的进展,基因工程论文

分析基因工程菌生产抗菌肽的的进展,基因工程论文内容摘要：当前，利用基因工程菌生产抗菌肽，提供有效和稳定的方式方法是抗菌肽生产的热门之一。了解抗菌肽工程菌表示出系统、生产量尤为重要，为此本文阐述了抗菌肽的生产方式，介绍了基因工程菌表示出系统的种类、组成及特点，分析了基因工程菌生产抗菌肽的主要困难因素，并对近些年利用基因工程菌生产抗菌肽的进展进行了综述。本文关键词语：抗菌肽;表示出系统;基因工程菌;ProgressinengineeringbacteriaproducingantibacterialpeptidesHUANGJia-MingJIANGNingZHANGAi-ZhongCollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversityAbstract：Recently,itistheoneofthehottopicforantimicrobialpeptides(AMPs)tobeproducedusingrecombinantexpressionsystemwithefficiencyandstableprotocols.Itisparticularlycrucialforustoknowdifferentexpressionsystemsweuseandtheirproduction.Forthispurpose,wenarratemethodstoproduceAMPs,species,elementsandpropertiesofdifferentexpressionsystems,mainlythereisananalysisforsomedifficultfactorstoconstructengineeredbacteria.And,wealsoreviewedtheprogressofproducingantibacterialpeptidesusingengineeredbacteriainrecentyears.Keyword：Antibacterialpeptide;expressionsystem;geneticallyengineeredbacteria;Fund：NationalNaturalScienceFoundationofChina(31472120);自第一个抗菌肽-天蚕素被发现以来[1]，迄今为止，已发现2400多种抗菌肽[2]。抗菌肽通常是由短氨基酸序列构成的小肽，具有广谱的杀菌活性[3]，对病毒和癌症细胞[4]都有一定的杀伤能力，除此之外还具有一定的免疫学活力。由于抗生素弊端的不断显现，使得抗菌肽也越来越多地作为一种潜在的抗生素替代物而被人熟知，抗菌肽的生产也遭到广泛关注。怎样获得大量具有更好抗菌活性的抗菌肽一直都是抗菌肽开发生产的主要内容。越来越多的研究表示清楚，相比于传统的分离法和化学合成法，采用基因工程技术是开发、生产抗菌肽的有效方式方法。一方面，经过基因工程技术得到的抗菌肽，能够作为产品进行鉴定和开发；另一方面，与其他的方式方法相比，基因工程法存在着能够大规模生产、成本低等潜在优势。并且近些年分子生物学和DNA重组技术的发展也为抗菌肽的基因工程化提供了良好的技术支持[2]。因而，系统了解基因工程菌生产抗菌肽技术利弊尤为重要。1抗菌肽的主要生产方式及困难因素当前获得抗菌肽的方式主要有下面几种：(1)从生物体内直接分离提纯有生物活性的抗菌肽，再对其构造和功能进行研究。近年来研究者在不同的动物中都获得了较好的进展，不仅从猪、牛等[5,6]常见动物中，也从大鲵、黑水虻[7,8]等生物中分离提纯出了有活性的抗菌肽。但这种方式方法比拟繁琐，且得到的抗菌肽含量普遍很低，不合适进行规模化生产，仅合适进行技术开发。(2)人工合成抗菌肽，根据已经知道的抗菌肽基因序列，用化学的方式方法合成抗菌肽[9,10]。但这种方式方法成本高、价格贵，不适于广泛普及应用。(3)酶解法，主要是通过将有抗菌活性的蛋白用特定的蛋白酶切割下其有抗菌活性的部分进行纯化，继而得到抗菌肽。鱼鳞抗菌肽就是通过该法得到的[11]。Esmaeilpour等[12]也通过该法从山羊乳清蛋白中分离提纯出了有活性的抗菌肽。这种方式方法得到的抗菌肽活性较高，但是纯化比拟费事，产量低，需要的成本也较高。以上3种方式都是获得抗菌肽的可行手段，但都因存在其短板而制约抗菌肽的规模化生产。而利用基因工程菌来生产抗菌肽，能够在一定程度上解决这些困难。通过这种方式方法得到的抗菌肽目的性强，技术上有提高产量的技术空间，十分是应用可食用工程菌，成本低、应用广，是生产抗菌肽的一条理想途径。2基因工程菌生产抗菌肽当前用于基因工程菌的异源表示出系统在生产不同大小、折叠和复杂性的异源抗菌肽方面获得了很大的进步。不同的抗菌肽因其不同的特征，在选择用于生产的宿主系统时应该仔细挑选，例如大小，细胞内的定位或分泌、正确的折叠和糖基化的方式等。有研究表示清楚，抗菌肽生产的主要表示出系统是细菌和酵母表示出系统。作为表示出系统，他们的组成基本一样，都是由外源基因、表示出载体及宿主菌组成。但又由于真核与原核的差异，也使得它们存在着各自的特点。详细的将在下面章节进行简单的阐述。2.1大肠杆菌生产抗菌肽2.1.1大肠杆菌表示出系统生产抗菌肽大肠杆菌表示出系统是应用最早的表示出系统，对其的研究也就更为深切进入，在所有基因工程菌生产抗菌肽的方式方法中大肠杆菌表示出系统是最常见的。清楚明晰的遗传学背景、成熟的表示出技术以及菌体生长快等特点使其得到了广泛的应用。这也使各种类型的抗菌肽都实现了在大肠杆菌中的表示出。研究表示清楚一般抗菌肽在大肠杆菌中的表示出量因载体种类和抗菌肽的种类不同而不同，人源抗菌肽表示出产量多数是比拟高的[13]。例如，复合抗菌肽AL32-P113和重组抗菌肽UBI18-35实现了在大肠杆菌中的表示出，并得到了可观的表示出量12.1mg/L[14]、6mg/L[15]。但其他抗菌肽也有一定的开发空间，如Fowlicidin-3在大肠杆菌BL21Rosetta中的融合表示出，得到了表示出量为0.84mg/mL和0.71mg/mL的抗菌肽Trx-Fowlicidin-3a和Trx-Fowlicidin-3b[16]。抗菌肽SMAP-29融合表示出时，对表示出条件进行优化后得到了最高表示出量占菌体11.35%的抗菌肽SMAP-29[17]。黄粉虫抗菌肽基因在大肠杆菌中也获得了较高的抗菌肽表示出量，占细菌总蛋白的40%以上[18]。当前，用大肠杆菌来生产抗菌肽的方式方法已经特别的成熟，并获得了广泛的应用，是抗菌肽规模化生产的一条有效途径。2.1.2大肠杆菌表示出系统生产抗菌肽的困难因素影响大肠杆菌表示出系统生产抗菌肽的因素：(1)大肠杆菌表示出系统由于没有像真核生物一样后期的翻译即修饰蛋白的能力，导致了中间产物的过度累积，容易构成包容体构造。包容体的构成有利有弊，首先在表示出抗菌肽的技术中存在有利的生物技术策略，由于这能构成丰富而又比拟纯的重组蛋白，易于从宿主中分离，其次还能抵抗体内蛋白酶分解。缺点就是目的肽在包容体构成经过一般是不可直接控制的，而有效控制的方式方法是在融合表示出经过中有望进行包容体的表示出[19]。由于后期的翻译能力弱，也使得分泌的抗菌肽的稳定性较弱，活性弱。(2)容易产生内毒素，这会导致抗菌肽在后期表示出经过中容易对宿主造成自杀现象，即杀灭本身的宿主菌。(3)表示出载体的选择。不同类型的表示出载体也会对抗菌肽的生产产生不同的影响，当前常见的功能性的表示出载体有3种[20]：非融合型、融合型以及分泌型的表示出载体。非融合型表示出载体的主要特点是得到的抗菌肽与天然抗菌肽有着很高的类似性，如pPL-Lamda；融合型表示出载体能够简化提纯步骤，如pGEX系列；分泌型的表示出载体的主要优点是防止分泌抗菌肽被宿主内蛋白酶降解，如pEZZ18。(4)培养条件。培养条件也会对大肠杆菌生产抗菌肽产生影响，大肠杆菌表示出系统理想的培养条件是，有适量的微量元素如：Mg+、Ca2+、K+和NH4+，以及充足的能量等。2.2酵母菌生产抗菌肽2.2.1酵母表示出系统生产抗菌肽酵母是真核生物，本身具备单细胞快速生长和易于遗传操作的优点，除此之外，对后期蛋白质的正确加工和翻译后的修饰都要强于大肠杆菌。表如今酵母的糖基化以及多聚糖构造糖蛋白的产生。由于其诸多优点使其作为表示出系统的研究也不断深切进入。毕赤酵母是酵母表示出系统中应用最为广泛的表示出系统，但由于没有稳定的附加体质粒，使其在表示出外源抗菌肽基因时，所用的表示出载体几乎都是能够直接整合到酵母基因组中的整合型质粒载体，如pPICZ和pIPC3k等。表示出系统中用于生产抗菌肽的宿主菌株都是通过原野生型菌株NRRL-Y11430经过改进得到的[21]。毕赤酵母是甲醇营养型酵母，能够在只要甲醇的培养基中生长，而在其他培养基中几乎不生长，因此甲醇能够用于转化后重组菌株的挑选。有研究表示清楚，与大肠杆菌相比毕赤酵母往往能获得更好的效果。例如，抗黄曲霉毒素B1在大肠杆菌和毕赤酵母中分别表示出，但后者的表示出量是前者的1.3倍[22]。多种抗菌肽实现了在酵母菌中的表示出，而且得到了可观的表示出量。抗菌肽Moricin的基因经扩增后导入毕赤酵母，实现了高表示出，经发酵在上清液中得到248.98mg/L的重组蛋白[23]，经检测有明显的抑菌活性。抗菌肽Snakin-1在毕赤酵母中成功表示出，得到了表示出量为40mg/L的抗菌肽[24]。重组表示出载体pPICZA-GST-Apidaecin在毕赤酵母菌中实现表示出，成功表示出出有明显抗菌活性的Apidaecin型抗菌肽，表示出量为1.76g/L[25]。以上研究表示清楚，通过毕赤酵母菌生产抗菌肽是一种有效的生产方式方法，而且相对于大肠杆菌，作为真核表示出系统的毕赤酵母具有更多的优势。2.2.2毕赤酵母表示出系统生产抗菌肽的困难因素外源抗菌肽基因在毕赤酵母中表示出时，有很多的因素都会影响抗菌肽的生产。(1)外源抗菌肽基因本身的内在因素。选用毕赤酵母偏爱的密码子能够在一定程度上提高抗菌肽的表示出效率。(2)mRNA5端非翻译区的组成长度与AOX1/MOX保持一致可以以提高抗菌肽产量。(3)UTR序列、A+T含量和基因的拷贝数等都会在一定程度上限制抗菌肽的生产量。研究表示清楚，A+T含量在30%?55%之间为最好，A+T的含量越高越容易产生类似终止子之类的构造，影响抗菌肽的生产。(4)毕赤酵母本身分泌蛋白酶，对外源抗菌肽有一定的溶解作用，这是其面临的主要问题。当前主要的解决方式是通过降低培养基pH以及在培养基中添加蛋白质水解产物等方式来提高抗菌肽的表示出量，除此之外采用蛋白酶缺陷的宿主菌如SMD1168可以以提高其生产量。2.3枯草芽胞杆菌生产抗菌肽2.3.1枯草芽胞杆菌表示出系统生产抗菌肽枯草芽孢杆菌是遗传和生理水平最好的革兰氏阳性菌之一。其染色体的整个序列是已经知道的，这极大地加快了基因工程技术的应用进程。经太多年努力，芽孢杆菌表示出系统已经克隆和表示出了多种真核和原核的外源基因。徐建[26]成功构建表示出载体pMK-BD-2/CP1,并实现了融合抗菌肽pBD-2/cecropinP1在枯草芽孢杆菌中的表示出，表示出量为45mg/L，经历体验证有良好的抗菌活性。魏丹丹[27]将两个含抗菌肽PR-FO基因的表示出载体质粒，分别导入枯草芽孢杆菌中进行诱导表示出，最终得到了具有抗菌活性的表示出量为3mg/L和4mg/L的抗菌肽PR-FO。通过人工合成抗菌肽的目的基因序列，将其与表示出载体pHT43进行连接，构建重组表示出质粒pHT43/SS-BD[28]和pHT43/CC34[29]，转入到枯草芽孢杆菌中，成功表示出出有抑菌效果的抗菌肽-defensi和CC31。除此之外，抗菌肽阴极诱导素-BF和抗菌肽Abaecin也实现了在枯草芽孢杆菌中的表示出，表示出量分别为0.5mg/L和3mg/L[30,31]。以上研究表示清楚，枯草芽孢杆菌作为基因工程菌也为抗菌肽的生产提供了一条良好的途径。2.3.2枯草芽胞杆菌表示出系统生产抗菌肽的困难因素枯草芽胞杆菌表示出系统在抗菌肽的生产中主要有下面几点限制因素：(1)枯草芽孢杆菌本身分泌蛋白酶，会降解一部分分泌表示出的抗菌肽而影响表示出量。(2)不能高效的表示出，抗菌肽的表示出效率低，这也是其亟待解决的问题。(3)质粒的不稳定性表如今两方面，即构造的不稳定性和分离的不稳定性。前者容易引起抗菌肽基因片段的丢失和构造的改变，后者容易导致表示出载体质粒的丢失。使用整合性质粒是解决质粒不稳定性的一条有效途径。2.4乳酸菌生产抗菌肽2.4.1乳酸菌表示出系统生产抗菌肽乳酸菌是一种益生菌，本身就能够产生抗菌和杀菌物质，不产生内毒素，表示出的抗菌肽和菌体能够一起用来饲喂动物，经过改造的乳酸菌几乎不分泌本源蛋白，也就间接降低了抗菌肽被内部分解的风险。因而它与其他表示出系统相比存在一些天然优势。随着分子生物学和基因工程技术的发展也使乳酸菌表示出系统有了更进一步的发展。有研究表示清楚已有抗菌肽在乳酸菌中实现成功表示出，例如李朴等[32]成功实现了抗菌肽Baetenecin7在乳酸菌中的表示出，得到了具有生物活性的抗菌肽Baetenecin7。但并没有实现对其表示出量的测定。谭嘉圣等[33]也成功实现了人源抗菌肽LL-37在乳酸菌NZ9000中的表示出。这表示清楚了乳酸菌表示出系统作为一种新型表示出系统，也有着生产抗菌肽的潜能。可以以作为抗菌肽开发以及规模化生产的途径。2.4.2乳酸菌表示出系统生产抗菌肽的困难因素乳酸菌表示出系统作为生产抗菌肽的新兴系统，已渐渐被人们所熟知以及应用，但也存在的一些问题与缺乏。首先就是乳酸菌作为表示出系统在表示出抗菌肽方面的研究报道较少，当前对乳酸菌表示出系统的研究还处于探寻求索阶段，对其遗传背景的认识还很薄弱，这限制了其发展。其次蛋白表示出效率低以及信号肽分泌效率的不稳定都是影响抗菌肽生产的重要因素。2.5基因工程菌生产抗菌肽形式图为了能更直观地看到抗菌肽在基因工程菌的生产经过，图1为抗菌肽在基因工程菌中生产经过的形式图。图1基因工程菌生产抗菌肽形式图Figure1Patternofantimicrobialpeptidesproductionbygeneticallyengineeredbacteria3小结与瞻望在抗生素滥用的大背景下，抗菌肽拥有着诸多优点无疑是代替抗生素的最佳选择，但抗菌肽的开发一直是亟待解决的难题，固然通过基因工程菌生产抗菌肽在一定程度上解决了抗菌肽的生产困难，但也面临着诸多的问题。(1)基因工程得到的抗菌肽与天然纯化分离得到的抗菌肽存在差异。(2)表示出产量低。(3)抗菌肽的毒性问题，有研究表示清楚部分抗菌肽会导致受体细胞的自杀行为，以及分泌的抗菌肽也会杀伤受体细胞。(4)本身分泌蛋白酶，会降解抗菌肽，影响抗菌肽的表示出量。面对以上问题当前采取的主要解决方式是利用生物信息学对抗菌肽分子进行改造。(1)利用生物信息技术对抗菌肽的分子构造进行改造，以期得到对对宿主杀伤性小，不易被宿主分泌的蛋白酶分解的新型抗菌肽。(2)抗菌肽基因的串联技术，对抗菌肽基因进行串联，通过提高抗菌肽目的蛋白的产量来间接提高抗菌肽的表示出量，这是一种提高抗菌肽表示出量的方式方法。除此之外，对抗菌肽进行串联可以以掩蔽单体抗菌肽的活性，来到达降低抗菌肽毒性的目的。(3)融合表示出，有研究表示清楚，将抗菌肽与防止蛋白酶降解的基因进行融合表示出，能够降低抗菌肽在宿主菌内被其分泌的蛋白酶分解的风险。另一种防止抗菌肽被宿主蛋白酶分解的方式方法就是采用包容体的形式表示出。这样不仅能够降低抗菌肽被分解的风险，也降低了抗菌肽本身对宿主菌的毒害作用。面对诸多的难题，固然研究者采取了相应的措施，但怎样获得产量高，活性更好的抗菌肽还需进一步探寻求索，近年来越来越多抗菌肽分子改造技术的以及表示出系统的新技术相继被报道，也为抗菌肽的开发带来了更多的选择。相信在不久的将来，在研究者的不断努力下，抗菌肽势必会有更好的将来，来造福于人类。以下为参考文献[1]SteinerH,HultmarkD,Engstr?m?,etal.Sequenceandspecificityoftwoantibacterialproteinsinvolvedininsectimmunity[J].Nature,1981,292(5820):246-248[2]QiL,JiangN,ZhangAZ,etal.Researchpresentstatusandreformstrategyofantimicrobialpeptides[J].ChinaAnimalHusbandryVeterinaryMedicine,2021,43(2):450-456(inChinese)[3]AbdelbaqiS,DeslouchesB,SteckbeckJ,etal.Novelengineeredcationicantimicrobialpeptidesdisplaybroad-spectrumactivityagainstFrancisellatularensis,YersiniapestisandBurkholderiapseudomallei[J].JournalofMedicalMicrobiology,2021,65(2):188-194[4]BandyopadhyayS,LeeM,SivaramanJ,etal.ModelmembraneinteractionandDNA-bindingofantimicrobialpeptidelasioglossinIIderivedfrombeevenom[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2020,430(1):1-6[5]XiaYH.Isolation,purificationandactivityanalysisofantimicrobialpeptideSSH19fromswinespleen[D].Xinxiang:MastersThesisofHenanUniversityofScienceandTechnology,2021(inChinese)[6]ZhangBQ.Isolation,purificationandactivityanalysisofantimicrobialpeptideBSN27frombovinespleen[D].Xinxiang:MastersThesisofHenanUniversityofScienceandTechnology,2021(inChinese)[7]ParkSI,YoeSM.Anovelcecropin-likepeptidefromblacksoldierfly,Hermetiaillucens:isolation,structuralandfunctionalcharacterization[J].EntomologicalResearch,2021,47(2):115-124.[8]PeiJJ,JiangL.AntimicrobialpeptidefrommucusofAndriasdavidianus:screeningandpurificationbymagneticcellmembraneseparationtechnique[J].InternationalJournalofAntimicrobialAgents,2021,50(1):41-46[9]WangXQ,GaoY,YinZF,etal.SolidPhasesynthesisandanti-microbialactivitiesoftheantibacterialpeptideIB-367[J].ChineseJournalofSyntheticChemistry,2021,24(7):600-603(inChinese)[10]IsakssonJ,BrandsdalBO,EngqvistM,etal.Asyntheticantimicrobialpeptidomimetic(LTX109):stereochemicalimpactonmembranedisruption[J].JournalofMedicinalChemistry,2018,54(16):5786-5795.[11]ShiYQ,WangQQ,WuLD,etal.OptimizationofpreparationofantimicrobialpeptidesbyTwo-Stepenzymatichydrolysisoffishscalesusingresponsesurfacemethodologyandantimicrobialactivityofpuri?edantimicrobialpeptide[J].FoodScience,2021,39(6):155-161(inChinese)[12]EsmaeilpourM,EhsaniMR,AminlariM,etal.Antimicrobialpeptidesderivedfromgoatsmilkwheyproteinsobtainedbyenzymatichydrolysis[J].JournalofFoodBiosciencesandTechnology,2021,7(1):65-72[13]ParachinNS,MulderKC,VianaAAB,etal.Expressionsystemsforheterologousproductionofantimicrobialpeptides[J].Peptides,2020,38(2):446-456.[14]WanmakokM,OrrapinS,IntorasootA,etal.ExpressioninEscherichiacoliofnovelrecombinanthybridantimicrobialpeptideAL32-P113withenhancedantimicrobialactivityinvitro[J].Gene,2021,671:1-9[15]AshcheulovaDO,EfimovaLV,LushchykAY,etal.ProductionoftherecombinantantimicrobialpeptideUBI18-35inEscherichiacoli[J].ProteinExpressionandPurification,2021,143:38-44[16]HeZQ,LiuTJ,LYJ,etal.BiologicalcharacteristicsoftheantibacterialpeptideFowlicidin-3fusionexpressedinEscherichiacoli[J].JournalofYangzhouUniversity(AgriculturalandLifeScienceEdition),2018,32(4):1-6(inChinese)[17]WuSQ,ZhaoGJ,WanJ,etal.OptimizationofexpressionconditionsandpurificationofantibacterialpeptideSMAP-29inEscherichiacoli[J].JiangsuAgriculturalScience,2021,46(9):44-47(inChinese)[18]AlimuR,MaoXF,LiuZY.ExpressionoptimizationandcharacterizationofTenebriomolitorantimicrobiolpeptidesTmAMP1minEscherichiacoli[J].ChineseJournalofBiotechnology,2020,29(6):836-847(i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