组织化学技术酶组化

关于组织化学技术酶组化第1页，共34页，2023年，2月20日，星期五2023/3/51※特点：①在原位检测②检测酶的活性而不是酶分子本身酶的分类：按生物化学分类——六大类①氧化还原酶②转移酶③水解酶④裂解酶⑤异构酶⑥连接酶常用检测方法1．沉淀法①金属沉淀法：Ca++—Co++法；Pb法②偶联法：重氮盐法

③靛原法④四唑盐法第2页，共34页，2023年，2月20日，星期五22．后偶联法Post-coupling（ACP）3．合成法4．底物膜法设计半透膜切片/孵育法★★★影响酶组化实验的关键因素①酶活性的保存a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不同的酶适用不同的固定剂△抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。△慎用醛

第3页，共34页，2023年，2月20日，星期五3b）取材：快捷，实验准备充分。冰结切片应先备液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定（丙酮∶氯仿=1∶1）4℃，5～10分钟，但脂溶性蛋白脱落。②底物浓度A）量要足够1∶20V/VB）孵育法只能用一次，配制时要适量（节俭）③PH和渗透压应以缓冲液调节④温度控制与时间：室温37℃（40min）4℃（5～10min）第4页，共34页，2023年，2月20日，星期五4⑤捕获剂亦要求一定浓度，要以反应原位瞬时沉淀。⑥激活剂与抑制剂（对照）a）两者的选择都应具有特异性。b）要有适当的浓度范围⑦时间：通过实验自行摸索。任何配方都是一个很大的范围（指时间），受多种因素的影响，因药品的质量、环境因素的变化而变化。故不可轻信之。⑧扩散：控制反应速度，避免扩散（冰冻切片孵育尤应注意）第5页，共34页，2023年，2月20日，星期五5⑨对照：必须设立对照，以防非特异反应。这对结果的解释非常重要。★★★对结果的分析，应考虑如下几个问题：①经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟能保留多少？②酶是否在原位？③反应中多少酶起了作用？④酶的活性是否代表细胞生活时的活性？⑤沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延长，会不会改变？⑥是否有扩散移位第6页，共34页，2023年，2月20日，星期五6

一、钙—钴法显示碱性磷酸酶

AlkalinePhosphatase（ALP）〔原理〕以天然存在的β—甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。反应式如下：第7页，共34页，2023年，2月20日，星期五7第8页，共34页，2023年，2月20日，星期五〔方法〕标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片）厚6微米。固定：丙酮∶氯仿（1∶1）混合液。4℃2~5′①切片标本入下列孵育液中，37℃，5分钟孵育液：3％β—甘油磷酸钠6ml底物保2％巴比妥钠6ml调PH证2％氯化钙（无水）9ml沉淀剂新2％硫酸镁6ml激活剂

鲜蒸馏水3ml30ml将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4。第9页，共34页，2023年，2月20日，星期五

②流水流水洗2分钟后→入蒸馏水③入2％硝酸钴，5分钟（小肠可3分钟）置换Ⅰ④流水洗5分钟，入蒸馏水。⑤入0.5硫化胺，2分钟。置换Ⅱ⑥流水洗10分钟，入蒸馏水。⑦入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟⑧流水洗5分钟→蒸馏水。⑨甘油明胶或Apathy糖胶封固。

第10页，共34页，2023年，2月20日，星期五结果：肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛纹状缘和血管内皮出现黑色的硫化钴沉淀，显示ALP活性强。△ALP为一种膜酶，广泛存在于肾小管、小肠绒毛、膀胱、肾上腺、包曼氏囊、肝、脾、乳腺及卵巢等细胞膜，与细胞的吸收有关。〔对照〕①无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中的3％

β—甘油磷酸钠，其余各步进行同上。第11页，共34页，2023年，2月20日，星期五②加热灭活酶活性。③加抑制剂，左旋咪唑0.1～1.0mmol/L〔注意事项〕①〔Ca2+〕要足量②硫化钠（NH4）S配置成淡黄色，可提供

S2-〔滴2～3滴〕③用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性。④有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色素）出现，可影响结果。★本法可用显示：5—核苷酸酶、肌蛋白

ATPase、ALP第12页，共34页，2023年，2月20日，星期五二、铅法——显示酸性磷酸酶

（Gomori，1950Lojda，1979）〔原理〕以β—甘油磷酸钠为底物，在酸性PH下，被ACP水解，释放出磷酸盐，遇铅离子则生成磷酸铅沉淀。在被S2-置换，最终生成硫酸铅棕色沉淀。反应式如下：★酸性磷酸酶AcidPhosphatas（ACP）第13页，共34页，2023年，2月20日，星期五第14页，共34页，2023年，2月20日，星期五※ACP的特性①PH4.5～5.5适宜②激活剂：Mn2+③抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。〔ACP定位〕①溶酶体（颗粒状）内；②溶酶体外ACP存在于ER和胞液。③该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、肾上腺。第15页，共34页，2023年，2月20日，星期五〔方法〕标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6微米。固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可用甲醛，但影响活性。本实验不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）混合液，4℃，2～5min步骤：①将标本放于下列孵育液中37℃，10～15′

孵育液：0.1M醋酸缓冲液，PH5.215ml0.24％硝酸铅15ml第16页，共34页，2023年，2月20日，星期五3％β—甘油磷酸钠3ml33ml

混匀，置37℃水浴中15～30分钟后，过滤。②于37℃蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温蒸馏水洗）③入5％硫化胺，1～2分钟。④流水冲洗3～5分钟后，换蒸馏水。（可用Mayer苏木素复染核）⑤用甘油明胶或Apathy氏糖胶封固。第17页，共34页，2023年，2月20日，星期五〔结果〕酶活性部位→棕黑色硫化铅沉淀。分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒。〔对照〕孵育液内加0.01MNaF（13.9mg/33ml）→（—）〔注意事项〕①铅离子的浓度→关键问题，没有底物，有些组织吸附铅离子（+），因此必须用NaF

抑制酶活性→排除假阳性反应。②孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。第18页，共34页，2023年，2月20日，星期五［应用范围］“铅法”适用于：ACP，5’--核苷酸酶G—6—P酶;膜ATPaseMito—ATPaseTTPase（硫胺素焦磷酸酶）三、偶氮偶联法显示ACP［原理］以奈酚的衍生物磷酸脂NaphtholAS—BLPhosphate为底物，在酸性PH（5.2）下，经酸性磷酸酶水解释放出NapholAS—BI，立即与六氮化对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。第19页，共34页，2023年，2月20日，星期五［方法］标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6微米。不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）混合液内，4℃，2～5min①标本入下列孵育液，37℃，30～60分钟。孵育液：磷酸奈酚AS—BI15mg

溶于二甲基亚砜0.6ml六氮化对品红缓冲液30ml30.6ml

第20页，共34页，2023年，2月20日，星期五充分混匀并过滤②蒸馏水洗③入Mayer苏木精内染1分钟。④流水冲5分钟后入蒸馏水。⑤用Apathy糖胶或甘油明胶封固。［结果］酶的活性部位呈红色，核兰色。分布于肾近端小管核周，肝毛细胆管周围。※ACP是溶酶体的标志酶。※※六氮化对品红液的配制（30ml）第21页，共34页，2023年，2月20日，星期五①4％对品红盐酸溶液碱性品红400mg

浓盐酸2ml

蒸馏水8ml②4％NaNO3配好后于冰箱保存用时取1ml。①+②等量混匀（各取1ml），盖严并置室温静止一分钟，待混合液变为淡黄色→倒入28ml2.72％醋酸钠溶液，用1NNaOH调PH至5～5.5即成。第22页，共34页，2023年，2月20日，星期五四、四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶

［对照］用抑制剂NaF浓度为10mmol/LCa2+浓度为10mmol/L［注意事项］①六氮盐浓度不能太高②背景会略带黄色［应用范围］本法用于ALP、ACP、非特异性脂酶。第23页，共34页，2023年，2月20日，星期五［原理利用］利用H受体的H2，使四唑还原成甲月替：反应式如下：第24页，共34页，2023年，2月20日，星期五第25页，共34页，2023年，2月20日，星期五本实验：以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（nitroBT）为受H体，其接受H后被还原成甲月替

呈紫色以代表琥珀酸脱氢酶的活性。※琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。△抑制物：丙二酸盐（竞争抑制），磷酸盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸（竞争抑制）凡与-SH基化合的作用剂皆抑制其活性。［方法］第26页，共34页，2023年，2月20日，星期五标本：大白鼠肝、肾或心肌。横冷箱切片，后6微米不固定。步骤：①将标本放入下列孵育液中，37℃，约5分钟。孵育液：nitroBT10mg0.1MPBS，PH7.810mlPMS（吩嗪硫酸甲酯）1mg

徐徐加温，使其溶解，冷却过滤。再加入琥珀酸钠80mg②蒸馏水洗净第27页，共34页，2023年，2月20日，星期五③Apathy氏液糖胶封固［结果］酶活性部位成蓝紫色沉淀。此标本内所见蓝紫色颗粒即线粒体。［对照］孵育液去底物，加入等量蒸馏水，同时孵育（—）［注意］①甲月替易溶于脂，反应扩散时组织内脂滴被染。②加入PMS（中间递氢体）定位更加准确。③如果聚乙烯醇PVA，可以保护线粒体膜，使反应局限在线粒体内。［应用范围］适用于：甲胺氧化酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶。第28页，共34页，2023年，2月20日，星期五五、DAB法显示过氧化物酶〔原理〕过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。第29页，共34页，2023年，2月20日，星期五〔光镜显示方法〕（1）孵育液的配置：预孵育液：

DAB4HCL10mg

溶于蒸馏水5ml0.2M磷酸缓冲液（PH6.5）5mlFahimi孵育液:

DAB4HCL10ml

溶于蒸馏水5ml0.2M磷酸缓冲液（PH6.5～7.0）5ml第30页，共34页，2023年，2月20日，星期五0.3％H2O20.1mlGraham—K孵育液：

DAB4HCL5mg0.05MT—H缓冲液（PH