一株光合细菌的分离鉴定及污水处理能力研究

PAGE904生态环境第15卷第5期（2006年9月）周洪波等：一株光合细菌的分离鉴定及污水处理能力研究PAGE903生态环境2006,15(5):901-904EcologyandEnvironmentE-mail:editor@基金项目：国家自然科学基金创新研究群体科学基金项目（50321402）；中南大学引进人才基金项目作者简介：周洪波（1969－），男，副教授，博士，主要从事资源环境微生物研究。E-mail:zhouhb@收稿日期：200一株光合细菌的分离鉴定及污水处理能力研究周洪波，刘飞飞，邱冠周中南大学资源加工与生物工程学院，湖南长沙410083摘要：光合细菌（photosyntheticbacteria,简称PSB）是一种在自然界广泛存在的具有光能合成体系的原核微生物，除可用作饲料添加剂外，还具有在好氧、微氧、厌氧多种条件下代谢废水中有机化合物、难降解卤化物等的能力，具有一定的工农业应用前景。本实验以实验室废水处理反应器活性污泥为材料，采用液体富集培养、平板反复划线分离方法，得到一株光合细菌，命名为PSB-O。经菌落形态特征、细胞形态特征、活细胞光吸收光谱特征、生理生化特性及16SrRNA基因分析，将PSB-O菌株鉴定为Rhodopseudomonassp.。将该菌用于连续培养反应器处理合成有机废水试验，结果表明PSB-O可以有效去除合成有机废水中的COD，在稀释率为0.025h-1时去除率达到最高62.8%，可以用于有机废水处理。关键词：光合细菌；鉴定；生长特性；有机废水中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1672-2175（2006）05-0901-04光合细菌（photosyntheticbacteria，简称PSB）是自然界中广泛存在、具有原始光能合成体系的原核生物，能在厌氧条件下进行不放氧的光合作用，现有19属约49个种[1]。PSB可用作饵料、饲料、菌肥，还可生产生物降解塑料和杀虫剂等[2-4]。由于光合细菌可广泛利用多种有机物在好氧、厌氧和微好氧条件下进行多种方式的生长代谢，在有机废水的净化处理中具有明显优势。PSB不仅能够降解简单的有机化合物，还能处理环境中较难降解的卤代化合物和芳香化合物。目前光合细菌已在近几十种有机废水处理中得以应用[5-8]。和传统活性污泥法相比，PSB处理法具有以下特点：有机质负荷高、设备规模小、动力消耗低、占地面积小、脱氮除磷效果好、管理简易，以及产生的菌体可综合利用，不存在污泥处理问题等优点。因此利用PSB处理高浓度有机废水是非常有前途的环境微生物技术。作者从实验室活性污泥样品中分离到一株光合细菌，通过形态和培养特征的观察、生理特征研究以及16SrRNA基因序列分析，将菌株鉴定为Rhodopseudo-monassp.；同时，对该菌处理有机废水的能力进行了初步研究。1实验部分1.1光合细菌的分离与培养①液体富集培养基：CH3COONa3.0g，CH3CH2COONa0.3g，NaCl1.0g，(NH4)2SO40.3g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO40.7g，CaCl20.05g，MnSO40.0025g，FeSO40.005g，酵母膏0.1g，谷氨酸1.0g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.4。②固体分离培养基：CH3COONa3.0g·L-1，酵母膏3.0g·L-1，CaCl20.3g·L-1，MgSO4·7H2O0.5g·L-1，琼脂20g·L-1，调pH7.4。采用液体培养和琼脂平板法相结合，反复多次挑取单菌落进行培养以获得纯培养物。培养条件：从本实验室依据连续进水周期循环活性污泥工艺（CASS）构建的污水处理反应器（反应器温度25℃，DO质量浓度4mg·L-1，连续稳定运行30d）中取少量活性污泥样品于装有120mL富集培养基的125mL血清瓶中富集，置于光照培养箱中30℃培养，照度为20001x。6~9d后，液体培养基变为红色，经摇床振荡稀释处理后，涂布和划线于平板固体培养基上，置于恒温培养箱中黑暗好氧培养，7d后获得单菌落。在平板固体培养基中重复划线3次以上，直到在显微镜下观察为纯菌。1.2菌落及菌体形态观察观察平板上生长的单菌落；菌体形态采用普通光学显微镜观察与扫描电子显微镜观察相结合；电境型号为JEOLJSM－6380LV扫描电子显微镜。1.3活细胞吸收光谱的测定取适量液体纯培养物在7000r/min×10min离心洗涤3次，悬浮于w=60％蔗糖水溶液中，用岛津UV3000型紫外可见分光光度计在波长300~650nm扫描。1.4生理生化特性测定1.4.1碳源利用试验以不含有机酸，且无生长因子的无机盐培养基作为基础培养基（即除去乙酸钠、酵母膏、谷氨酸的富集培养基），分别加入最终质量分数为0.3%的各种碳源，厌氧光照培养14d后观察试验结果。1.4.2氮源利用实验用去除（NH4)2SO4、谷氨酸、酵母膏的富集培养基作为基础培养基,在基础培养基中分别加入1g/L的下列氮源物质：蛋白胨、NH4Cl、NaNO3等,进行培养、观察。1.4.3初始pH值对光合细菌生长的影响将酵母膏和NH4Cl减半的富集培养基灭菌后调成不同的pH值，分别为5.5，6.3，7.2，8.0。接种后，用100mL的生理盐水瓶，30℃，光照培养。不同时间取样测定培养液的吸光度值（660nm），并用pH计测定培养液的最终pH值。1.516SrRNA基因分析1.5.1菌体DNA的提取细菌基因组提取采用上海生工生物工程技术服务有限公司UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒。1.5.216SrRNA基因的PCR扩增图1扫描电子显微镜照片Fig.1PhotographofPSB-ObySEM以所提取的细菌总DNA为模板，在Biometra公司TgradientThermocyclerPCR仪上进行16SrRNA基因扩增，所用引物为根据E.coli16SrRNA基因第8-27位碱基和1510-1492位碱基序列设计的原核生物16SrRNAPCR通用引物（正向引物fD1:5'-agagtttgatcctggctcag-3'；反向引物rp2:5'-acggctaccttgttacgactt-3'），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系（25μL）：10×PCRBuffer2.5μL；MgCl21.5μL；dNTP2μL；模板DNA2μL；引物fD1/rp2各0.5μL；Taq酶(1U/μL)0.5μL；双蒸水15.5μL。PCR程序：95℃预变性6min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。TaqDNA聚合酶购自Fermentas公司。1.5.3PCR反应完成后，经w=1％琼脂糖电泳，检测扩增片段的大小和特异性，将目的片断切下，使用OMEGAE.Z.N.A凝胶回收试剂盒纯化回收。1.5.416SrRNA基因片断的克隆及重组子筛选将回收的目的片断克隆到Promega公司的pGEM-T载体上，按照试剂盒说明书操作，通过蓝白筛选，挑取白色菌落用LB液体培养基过夜培养后用于测序，测序由上海博亚生物技术有限公司完成。1.5.516SrRNA基因序列分析获得菌株16SrRNA序列，用NCBI-Blast软件将测序结果在GenBank等数据库中进行同源性检索（/blast）。1.6光合细菌处理废水实验在一个容量为500mL的连续培养反应器中，以液体富集培养基为配方配制合成废水，化学需氧量（COD）为5000mg/L。通过调整恒流泵流速，以调整稀释率，如0.01，0.02，0.025，0.03，0.035，在各稀释率条件下运行到达稳态时（运行停留时间的5~10倍）测培养液的COD值，计算COD的去除率[9]，废水COD值采用重铬酸盐法进行测定。2结果与讨论2.1PSB的菌落形态分离到一株光合细菌命名为PSB-O，在琼脂平板上,30℃黑暗好氧培养,7d后形成圆形淡粉色菌落，直径1~2mm，表面微凸，光滑湿润，边缘整齐，有光泽。2.2PSB-O的菌体形态学特征菌体呈短杆状或球状，二分分裂繁殖，革兰氏阴性，有鞭毛，运动活跃。可在光照厌氧或黑暗好氧条件下生长，菌体大小(0.4~0.7)μm×(0.8~2.0)μm（图1）。2.3活细胞吸收光谱PSB-O菌株活细胞在300~650nm波长范围有3特征吸收峰，分别位于370nm、480nm、590nm(图2，下页)。该其中370nm处为细菌叶绿素a的特征吸收峰，480nm处为类胡萝卜素的特征吸收峰，590nm处为细菌叶绿素b的特征吸收峰[10]。由此认为：本实验条件下，PSB-O菌株活细胞中含有细菌叶绿素a、细菌叶绿素b和类胡萝卜素。2.4PSB-O菌株生理生化特性2.4.1碳源利用富集培养基扣除有机酸成分后，分别加入单一种类的碳源，观察在不同碳源存在的条件下菌体的生长情况。结果表明，该菌株可以在草酸钠、甲醇、乙醇、淀粉、麦芽糖、乳酸钠、碳酸氢钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸为碳源的培养基上生长，在添加丙酮、丙酸、硫代硫酸钠的培养基上不能生长。2.4.2氮源利用表1分离菌株对氮源利用情况Talbe1Utilizationofnitrogensourceofstrain氮源种类PBS-O氯化铵+硝酸钠-谷氨酸+蛋白胨+“-”表示该培养基上细菌无法生长；“+”表示该培养基上细菌能够生长不同氮源实验结果如表1所示，可以看出，PBS-O菌株在添加了氯化铵、谷氨酸、蛋白胨的培养基上生长良好。而在以硝酸钠为氮源的培养基上无法生长。2.4.3初始pH值对所分离菌株生长的影响表3初始pH值对分离菌株生长的影响（温度30℃Talbe3InfluenceofinitialpHongrowthofthePBS-OpH时间/h244872961201445.5±6.3±+7.2-±++++8.0--±+++“-”表示培养基无明显变化；“±”表示培养基开始变红；“+”表示培养基变成紫红色25030025030035040045050055060065070000.51.01.52.02.5590nm480nm370nm吸光光度值A扫描波长λ/nm图2PSB-O菌体活细胞吸收光谱Fig.2AbsorptionspectrogramoflivingPSB-Ocell2.5PSB-O菌株16SrRNA基因序列分析测序后，得到长度为1574bp的菌株16SrRNA基因序列。序列对比的结果表明，所分离的PSB-O菌株与GenBank中Rhodopseudomonassp.v-1的相似性水平达97％，结合菌株的形态学和生理学特性，可基本确定分离的菌株为Rhodopseudomonassp.。PSB-O菌株的GenBank序列登录号为：DQ1263382.6PSB-O菌株处理有机废水的初步研究表4不同稀释率条件下PSB-O对合成废水COD的去除率Talbe4TheCODremovalofsyntheticwastewaterbyPBS-Ounderdifferentdilutionrates稀释率/h-10.010.020.0250.030.035出水COD/(mg·L-1)29862312186126013006COD去除率/%40.3％53.8％62.8％48.0％40.0％表2不同pH值下光合细菌生长的观测（温度30℃Talbe2InfluenceongrowthofPBS-OcomesfromdifferentpHofmedium初始pH值8.0细菌数/(108·mL-1)0.841.721.931.59最终pH值8.7在连续培养反应器中，不同稀释率条件下PSB-O菌株对COD的去除情况如表4所示。从中可以看出，随着稀释率提高，光合细菌PSB-O对有机废水中COD去除率有一定提高，在稀释率为0.025h-1时达到最高62.8%，再增加稀释率，由于菌体停留时间缩短，对COD去除率下降。樊凌雯[6]等利用厌氧可溶化发酵-光合细菌（UASB-PSB）四级槽法处理糖蜜废液，CODcr和BOD5去除率分别达95.33%和96.12%以上；郑耀通[11]等人比较了游离光合细菌和固定化的光合细菌在改善鱼塘水质方面的效果，发现在COD初始值为77.8mg/L时，化学需氧量自然去除率为33.7％，加入游离光合细菌后，去除率达到44.6％，而固定化光合细菌则可使COD去除率上升到70.6%。王宇新[12]等人利用光合细菌连续处理工艺，在适宜条件下进行淀粉废水处理的中试研究，中试系统日处理量为4m3，CODcr最大容积负荷6.17kg/（m3结论（1）从活性污泥中分离到的一株光合细菌PSB-O经过形态学、生理生化以及16SrRNA序列分析，鉴定为Rhodopseudomonassp.。（2）光合细菌PSB-O在连续培养反应器中可以有效去除合成有机废水中的COD，在稀释率为0.025h-1时去除率达到最高62.8%，该菌株对有机废水COD有较强的处理能力，可以应用于有机废水的处理。参考文献：[1]BUCHANANRE.Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology[M].Baltimore,MD:TheWilliansandWilkinsCompany,1974:[2]吴永强,宋鸿遇.光合细菌固氮分子生物学研究进展[J].植物生理学通讯,1991,27(3):161-166.WUYongqiang,SONGHongyu..Advanceinthestudyonmolecularbiologyofnitrogenfixationinphotosyntheticbacteria[J].PlantPhysiologyCommunication,1991,27(3):161-166.[3]李勤生,谭德清,王业勤.微生物饲料添加剂对养殖渔类的促进作用[J].水生生物学报,1990,14(4):368-371.LIQinsheng,QINDeqing,WANGYeqin.Synergisticeffectsofmicrobialfeedstuffadditiveonfish[J].ActaHydrobiologicaSinica,1990,14(4):368-371.[4]NISSONH,DUNDASID.Hodospirillumsalinarumsp.Nov,ahalophilicphotosyntheticbacteriumisolatedfromaportuguesesaltern[J].ArchMicrobial,1984,138(3):251-256.[5]李景生,黄韵珠.应用PSB处理乳品厂废水的试验研究[J].环境科学研究,1997,10(3):17-20.LIJingsheng,HUANGYunzhu.ExperimentalstudyontheapplicationofPSBinthewastewatertreatmentofdiaryindustry[J].ResearchEnvironmentalSciences,1997,10(3):17-20.[6]樊凌雯,张肇铭,张德咏,等.利用光合细菌处理糖蜜酒精发酵废液中试研究[J].中国环境科学,1998,18(2):173-175.FANLingwen,ZHANGZhaoming,ZHANGDeyong,etal.Apilottextonthetreatmentofsugar-syrupalcoholfermentwastewaterwithphotosyntheticbacteria[J].ChinaEnvironmentalScience,1998,18(2):173-175.[7]朱核光,史家樑,徐亚同.光合细菌法处理酒糟废水的试验研究[J].上海环境科学,1995,14(1):8-10.ZHUHeguang,SHIJialiang,XUYatong.Treatmentofdistiller'sgrainswastewaterusingphotosyntheticbacteria[J].ShanghaiEnvironmentalScience,1995,14(1):8-10.[8]陈繁忠,朱好根,崔明超,等.利用光合细菌处理养猪场污水的试验研究[J].环境工程,2000,18(5):10-12.CHENFanzhong,ZHUHaogen,CUIMingchao,etal.Experimentalstudyonthetreatmentofdewagefrompiggeryusingphotosyntheticbacteria[J].EnvironmentalEngineering,2000,18(5):10-12.[9]水和废水检测分析方法[M].3版.北京:中国环境科学出版社,1997.TheMethodofDetectionandAnalyzeofWaterandWastewater[M].3rded.Beijing:ChinaEnvironmentalSciencePress,1997.[10]刘如林,刁虎欣,梁风来.光合细菌及其应用[M].北京:中国农业科学技术出版社,1991:94.LIURulin,DIAOHuxin,LIANGFenglai.PhotosyntheticBacteriaandTheirApplication[M].Beijing:ChinaAgriculturalPress,1991:94.[11]郑耀通,胡开辉.固定化光合细菌净化养鱼水质试验[J].中国水产科学,1999,64(5):55-59.ZENGYaotong,HUKaihui.Purificationofwaterqualitybyimmobilizedphotosyntheticbacteriaforfishculturing[J].JournalofFishURNALOFFISHERYSCIENCESOFCHINA,1999,64(5):55-59.[12]王宇新,刘春朝.光合细菌处理淀粉废水的中试研究[J].环境科学,1995,16(3):39-40.WANGYuxin,LIUChunchao.Experimentalstudyonthetreatmentofamylumwastewaterusingphotosyntheticbacteria[J].EnvironmentalScience,1995,16(3):39-40.Isolation,identificationandcharacterizationofaphotosyntheticbacteriumstrainZHOUHongbo,LIUFeifei,QIUGuanzhouSchoolofMineralsProcessingandBioengineering,CentralSouthUniversity,Changsha410083,ChinaAbstract:Photosyntheticbacteria(PSB),withthesystemofphotometricenergysynthesis,broadlyexistintheenvironment.Theycanbegoodf