5株鹅细小病毒的VP3基因的序列测定研究,病毒学论文

5株鹅细小病毒的VP3基因的序列测定研究,病毒学论文鹅细小病毒病又称小鹅瘟，其作为一种急性传染病给养鹅业造成了重大的经济损失，严重影响了养鹅业的健康发展。该病主要损害1月龄以内的雏鹅，发病后主要表现为精神萎靡、食欲废绝、严重下痢和渗出性肠炎等异常感觉和状态[1].该病的病原为鹅细小病毒〔GooseParvovirus,GPV〕，该病毒属于细小病毒科细小病毒属，GPV仅有一个血清型[2],病毒粒径约20nm,是当前已经知道的动物病毒中较小、较简单的病毒之一[3].我们国家学者方定一于1956年初次在江苏扬州发现并命名为小鹅瘟[1].匈牙利学者德舍氏〔Derzsys〕于1966年初次使用鹅胚分离到该病毒；1974年，世界家禽协会将其正式命名为Derzsys病，随后GPV不断蔓延至中国台湾[4]、匈牙利[5,6]、英国[7]、日本[8]、泰国[9]、德国[10]、美国[11]、瑞典[12]和波兰[13]等多个国家和地区，给全球养鹅业造成了严重危害。本研究从江苏省各市鹅场病死雏鹅的肝、脾、肠病料中分离到5株病毒。通过实验室诊断证明所分离的5株野外病毒均为小鹅瘟病毒，本研究中同时对该5株GPV的VP3基因进行序列测定并进行了系统的遗传进化分析。1材料与方式方法1.1材料1.1.1病料江苏省各市鹅场死亡的，具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织，病料来源及分离时间见表1.1.1.2种胚9~10日龄SPF胚购自北京梅里亚SPF种禽场；鹅胚购自高邮市非免种鹅场。1.1.3抗原与血清GPV琼扩标准抗原、阳性血清均由本研究中心制备。1.1.4试剂及仪器Taq酶、RNA酶、氨苄青霉素、IPTG、X-gal、dNTP、DNAmarker、pEASY-T3CloningKit和胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；EDTA、Tris碱、SDS和蛋白酶K购自Sigma公司；EcoRⅠ限制性内切酶购自Fermentas公司；其他试剂均为国产分析纯级；PCR扩增仪为美国ABI公司产品，型号为GeneAmpPCRSystem9700;高速冷冻离心机为美国Sigma公司产品，型号为3K15;小鹅瘟病毒VP3基因的特异性引物：P1:5-CCAAGCTACAACAACCACAT-3和P2:5-TGAGCGAACATGCTATGGAAGG-3,目的条带大小为539bp.1.2方式方法1.2.1病毒分离及传代取具有典型病变鹅的肝、脾、肠组织，剪碎，按1∶3参加灭菌PBS溶液，研磨，匀浆，经超声波处理后，5000r/min离心15min,反复冻融数次，取上清液加青、链霉素双抗至2000U/mL和2mg/mL,接种非免疫鹅胚，0.2mL/枚，置38℃孵育。收取72h后死亡鹅胚的尿囊液，分装成若干青霉素小瓶，每瓶1mL~2mL,-70℃冷冻保存备用。每代设不接种的正常鹅胚作对照。传代时尿囊液均作1∶100稀释，分别接种6~8枚鹅胚，每胚0.2mL,取72h~120h之间死亡的鹅胚尿囊液。1.2.2琼脂扩散试验〔AGP〕根据以下为参考文献所述的方式方法进行抗原纯化浓缩，取死亡胚尿囊液，经6000r/min离心20min弃沉淀，加等量氯仿混合，6000r/min离心30min取上清，经PEG6000弃沉淀浓缩20倍后制成待检抗原[14].参照(兽医微生物实验指导〕中的方式方法进行琼脂扩散试验[15].简述之，在琼扩板周围孔参加不同稀释度的标准抗小鹅瘟病毒阳性血清，中心孔依次参加标准抗原、待检病毒分离物和正常鹅胚尿囊液。1.2.3红细胞凝集试验根据前述方式方法将病毒液进行纯化后浓缩2倍制备待检病毒液。将待检病毒液用磷酸盐缓冲液在U型板中进行2倍连续倍比稀释，每孔25L,最后1孔加一样体积的磷酸盐缓冲液作对照。随即向各孔内参加25L的1%各种动物的红细胞，充分混匀，37℃放置15min后检查结果。1.2.4病毒基因组提取根据以下为参考文献[4]所述的方式方法提取GPV各分离株的基因组，简述之：500L尿囊液与裂解缓冲液〔含有pH8.0的50mM的Tris,5mMEDTA,2%SDS和200g/mL的蛋白酶K〕等体积的混合，完全混匀后使用等体积的酚氯仿〔苯酚∶氯仿=1∶1〕抽提两次，12000r/min离心10min后汲取上清使用两倍体积的无水乙醇进行沉淀，-20℃放置10min后12000r/min离心10min后弃上清，使用70%的酒精溶液清洗沉淀后TE缓冲液溶解，-20℃保存备用。1.2.5鹅细小病毒VP3基因的扩增及序列测定以提取的基因组DNA为模板、P1、P2为引物扩增VP3基因片段。反响条件如下：94℃预变性3min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环；最后进行72℃延伸5min.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。目的DNA片段与TA克隆载体相连后，经转化、挑斑、摇菌、质粒提取及鉴定后，将含有重组质粒的阳性克隆斑送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。1.2.6小鹅瘟病毒VP3基因遗传进化分析将测序结果进行BLAST搜索后，下载并整理了107株小鹅瘟病毒及19株番鸭细小病毒VP3基因的序列数据。使用Lasergene7.1软件包中的Meaglin软件进行比对，然后使用BioEdit软件进行序列整理，最后比照对后的序列进行遗传进化分析。遗传进化树利用MEGA6.0软件中的最大似然法进行构建，软件预测最佳替换形式为K2+G.2结果2.1病毒分离鹅胚接种后，多数胚死亡时间在60h~120h之间，未接种的对照鹅胚均健康存活。与对照鹅胚相比，感染胚可见绒毛尿囊膜增厚，胚胎发育阻滞，胚体全身严重出血，胚头充血严重〔图1〕；多数胚胎的心、肝、肾有出血，少数胚胎的心肌苍白。2.2琼脂扩散试验〔AGP〕结果琼脂扩散试验结果表示清楚，用死亡鹅胚尿囊液制备的病毒浓缩抗原能与GPV阳性血清发生沉淀反响，并与小鹅瘟诊断抗原和阳性血清构成的沉淀线吻合。2.3红细胞凝集试验结果所有5株病毒分离物均不凝集鸡、鸭、鹅、豚鼠及兔子的红细胞。2.4PCR鉴定结果GPV各分离株VP3基因扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均可见约539bp的目的条带，DNA大小与预期的结果相符〔图2〕，结果表示清楚这5株病毒分离物中均有GPV.经鸡胚接种实验、琼脂糖扩散实验及PCR检测实验充分证实了这5株病毒分离物均为GPV,并将1~5号病毒分离物分别命名为Gooseparvovirus/nanjing/09、Gooseparvovirus/taizhou/12、Gooseparvovirus/nantong/12、Gooseparvovirus/yangzhou/08、Gooseparvovirus/yangzhou/11.2.5小鹅瘟VP3基因遗传进化分析结果使用MEGA5.0遗传进化分析软件构建的ML进化树见图3,从遗传进化树来看，GPV与MDPV分布在不同的两个分支，这符合该病毒属一般规律[16,17].而GPV又进一步演化为3个分支。本研究中5株GPV分离株中有4株处于国内主要分支上，仅有1株〔Gooseparvovirus/yangzhou/11〕与当下市售活疫苗在同一分支。该结果表示清楚随着GPV病毒在野外的不断遗传变异，该病毒在不断的进化演变，进而出现了较新的基因型。3讨论本研究通过分离及鉴定获得了5株GPV野外分离株，并对这5株GPV进行了系统遗传进化分析。实验结果表示清楚国内主要分支已逐步构成了新的基因亚型，并且与中国台湾的主要分离株具有较近的亲缘关系。但中国台湾因其与大陆相分离的特点，也逐步出现了与内陆不同基因型的分支，其与波兰、美国、匈牙利、德国、英国及法国构成了国外分支。市售活疫苗为1961