热原检查法（兔法）

文件编号热原检查法（兔法）颁发部门XXXXXXX/X总页数执行日期编制者审核者批准者编制日期审核日期批准日期目的：建立产品中热原检查的标准操作规程。范围：产品的热原检查。责任：质量监督部。内容：本法适用于《中国药典（2010年版）》附录中“热原检查法—兔法”。4.1实验材料及用具：4.1.1天平：精度0.01或0.1mg供试品称量用精度0.1或1mg试剂称量用精度10g家兔称重用4.1.2电热干燥箱：（50-300±1）℃。4.1.3恒温水浴：（37-100±0.5）℃。4.1.4热原测温仪或肛门体温计，精度0.1℃。4.1.5家兔固定盒：盒的两侧有通气孔。4.1.6实验用具：注射器、烧杯、三角瓶、大称量瓶、吸管、移液管、表面皿、玻璃棒、广口试剂瓶、金属制密封器（均需去热原）、时钟、直镊、脱脂棉或细软卫生纸。4.1.7试剂：75％乙醇、凡士林或50％甘油、新蒸馏水（4小时内蒸馏）、灭菌注射用水（经热原检查，3只家兔中体温升高0.4℃的最多只有1只，且3只家兔体温升高总数低于1℃，或经细菌内毒素检查，含细菌内毒素低于0.5EU／m1）、无热原氯化钠（经250℃30分钟或200℃1小时或180℃2小时加热除热原）。4.2溶液配制：供试品溶液。4.2.1原料药：4.2.1.1精密称取适量，置烧怀、三角瓶或称量瓶中。4.2.1.2按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水，搅拌使溶解。4.2.2注射液：4.2.2.1用75％乙醇棉球消毒安瓶颈部，割开安瓶。4.2.2.2精密量取一定量药液。4.2.2.3按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水，混匀。4.2.3注射用生理盐水：4.2.3.1称取无热原的氯化钠适量至烧杯或三角瓶中。4.2.3.2加入供试品“注射用水”适量，配成0.9％的等渗溶液。4.3实验动物：4.3.1健康无伤、体重1.7-3.0kg、同一来源、同一品系家兔，雌兔应无孕，一兔一笼，标兔号。4.3.2新兔预选：4.3.2.1新兔经饲养7日后，进行预测体温，测温的条件与热原检查要求相同。4.3.2.2测量体温时，测温仪探头或肛门计插入肛门的深度各兔应相同约6cm，测温时间不得少于1.5分钟。4.3.2.3每1小时测温一次，共4次。4.3.2.44次体温均在38.0-39.6℃（一般多选用38.4-39.4℃）的范围内，且温度最高最低差数不超过0.4℃（以不超过0.35℃为佳）的家兔，可供3周内实验用。4.3.2.5录选新兔编号、登记入兔史记录卡，未被录选家兔，可饲养7日再予测体温1次，如仍不符合要求则淘汰。4.3.3家兔的重复使用：4.3.3.1供试品判定为符合规定的家兔，至少应休息2日，方可供下一次实验用。4.3.3.2供试品判定为需重复实验的家兔，应暂做休息处理，如重复合格，升温≥0.6℃的家兔，应重新测温挑选。4.3.3.3供试品判定为不符合规定的家兔，一般不再使用。如其组内家兔平均升温未达0.8℃且已休息两周以上，可重新测体温，合格者可用。4.3.3.4每一家兔的使用次数，最多为10次，体重逐渐减轻或超过3.0kg的家兔，不再使用。4.3.4复试用家兔：挑选体重在2.O-2.4kg、正常体温在38.8-39.2℃、使用过2-3次的家兔进行试验。4.4试验前的准备4.4.1测温仪或肛门温度计每3-6个月校验一次，不符合要求者不能使用。4.4.2用具的除热原：清洗干净的玻璃器皿、注射器、针头、直镊等放入金属制容器内，密闭，置电热干燥箱中经250℃30分钟或200℃1时或180℃2小时加热除热原。去除热原未曾开启的密封容器内用具，可供一周内使用。4.4.3实验室的温度：4.4.3.1实验室的温度应在17-28℃范围内。4.4.3.2实验室与饲养室的温度相差不得大于5℃。4.4.3.3试验全过程中，室温变化不得大于3℃。4.5检查法：4.5.1选符合规定的家兔，停止给饲料和水，称重后置于家兔固定盒内至少1小时。4.5.2每隔30分钟或1小时测量家兔体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。4.5.3当日使用的家兔，正常体温应在38.2-39.6℃范围内，且各兔间查差不得超过1℃。4.5.4每个供试样品用家兔3只，再测定正常体温后15分钟内给药。4.5.4.1供试品的剂量，应按该药项下的规定注射，未规定剂量的药品，可根据该药的药理性质，在不影响家兔正常生理的前提下，按体重计算（人按50kg计），用临床一次剂量的3-10倍。4.5.4.2供试品注射的体积，按家兔体重每kg不少于1ml，不大于10ml。体积在5-10ml/kg的溶液应在37-38℃预热后注射。4.5.4.3供试品配制完毕后，应在30分钟内注射于家兔体内。4.5.4.4注射前，先用75％乙醇棉球轻擦耳静脉的注射部位，从耳尖端静脉进针，如进针不利，应顺序向前进行。4.5.4.5注射完毕，拨出针头时，按住针孔数秒钟，止血。4.5.4.6需缓慢注射的药液，注射时间一般每兔不超过3分钟。4.5.4.7个别肌注品种，测温时间应适当延长2-3小时。4.5.5给药后每隔1小时测量体温1次，共3次。4.5.6温差计算：4.5.6.1注射药液后，以3次测得体温中最高的一次减去正常体温，为该兔体温的升高度数，如3次体温低于正常体温，则升温度数以“0”计。4.5.6.23次体温中最低的一次，减去正常体温，即为降温值。4.6结果判断：4.6.1判断复试：4.6.1.l初试3只家兔中仅有1只体温升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔升温均低于0.6℃但升温的总数达1.4℃或1.4℃以上，应另取5只家兔复试。4.6.1.2含有热原的供试品，一般在给家兔静脉注射后1-2小时出现升温高峰，当第3小时升温≥0.6℃时，宜复试后再作判断。4.6.1.33只家兔中有1只降温值≥0.6℃时，宜复试后再作判断。4.6.2判断合格：4.6.2.1初试3只家兔中，体温升高均在0.6℃以下，并且3只家兔升温的总数在1.4℃以下可判断为符合规定。4.6.2.2复试5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔数仅有1只，并且初复试合并，8只家免的升温总数为3.5℃或3.5℃以下，可判断为符合规定。4.6.3判断不合格：4.6.3.1初试3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔数有2只或2只以上，可判断为不符合规定。4.6.3.2复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0