生物技术制药全套资料专家讲座

第一章绪论第一节生物技术制药概念和内容一、生物技术制药概念1、生物技术制药：是指利用生物系统或经过生物反应过程生产药品技术。生物技术制药全套资料第1页2、生物技术制药学：是一门说明生物药品研制原理、生产工艺及其分离纯化技术应用学科。当代生物技术制药学是医学、药学、生物学、化学、工程学与当代生物技术等相结合而形成综合学科。当代生物技术包含：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程，生化分离工程。

生物技术制药全套资料第2页3、生物药品：是指以生物资源为原料或以生物技术为伎俩开发生产用作疾病预防、诊疗和治疗医药品。4、生物新技术药品：是指采取基因工程技术、细胞工程技术、抗体工程技术以及其它生物新技术开发生产重组蛋白质类、抗体类和核酸类药品。生物技术制药全套资料第3页二、生物技术制药研究内容和

包括技术领域1、发酵工程制药是指利用微生物代谢过程生产药品技术。利用发酵工程生产药品有：抗生素、维生素、氨基酸、核酸、有机酸、蛋白质和肽类、酶类、激素类和免疫调整剂类等。主要研究微生物优良菌种选育、发酵工艺优化和产品分离纯化等问题。

生物技术制药全套资料第4页2、基因工程制药是指利用重组DNA技术改造生物物种遗传物质结构，借助重组生物细胞以生产药品或预防、治疗疾病综合技术。主要研究对应目标基因分离、判定和克隆，基因重组载体构建与导入，目标产物表示及其分离纯化等问题。生物技术制药全套资料第5页3、细胞工程制药在细胞和细胞器水平上对生物遗传物质改造基础上，利用动、植物细胞大规模培养来生产药品技术。可生产天然动、植物药品，疫苗，人类生理活性因子等重组DNA产品。主要研究动、植物细胞高产株系选育、培养条件优化、新型生物反应器设计和应用以及产物分离纯化等问题。生物技术制药全套资料第6页4、酶工程制药是指利用游离或固定化酶为催化剂生产药品技术。作用：除能全程合成药品分子外，还能用于药品分子转化。特点：生产工艺结构紧凑、专一性强，目标产物产量高、轻易回收，酶可重复利用等特点。任务：主要研究酶起源，酶分离制备，酶固定化，酶反应器及对应操作条件优化等。生物技术制药全套资料第7页5、生化工程制药是指利用生化分离技术从生物反应液或天然生物资源中提取分离制备药品技术。主要研究药用生物资源选择，药用成份种类、含量及其分布，药品结构、性质及其提取纯化工艺优化。生物技术制药全套资料第8页作业：1、名词解释生物技术制药，生物药品，生物新技术药品2、生物技术制药包括技术领域

生物技术制药全套资料第9页第二节生物药品性质与分类一、生物药品性质1、药理学特征（1）治疗针对性强，疗效可靠。治疗生理、生化机制合理，如胰岛素治疗糖尿病。（2）药理活性高。是从大量原料中精制出高活性物质。生物技术制药全套资料第10页（3）毒副作用小，营养价值高。主要有蛋白质、核酸、糖类和脂类等。（4）生理副作用常有发生。生物间存在种属和个体差异，不一样生物中活性物质结构有很大差异，常出现免疫反应、过敏反应。生物技术制药全套资料第11页2、在生产、制备中特征（1）有效物质含量低，杂质种类多且含量高。如：胰腺中胰岛素含量仅为0.002%，生长激素抑制素（Somatostatin）在十万只羊下丘脑中仅含有1mg。（2）稳定性差，易变性、易失活。生物药品以其严格空间构象来维持其生物活性功效，含有特定活性部位，一旦遭到破坏，就失去其药理作用。

生物技术制药全套资料第12页（3）易腐败。

均为营养价值高物质，极易染菌、腐败，从而造成有效物质被破坏、失去活性。（4）对环境条件敏感，生产条件改变对产品质量影响较大。（5）相对分子量较大（几千至几百万），组成份复杂，常以多组分存在，大多是复杂蛋白质混合物。生物技术制药全套资料第13页（6）用量少，价值高。（7）注射用药有特殊要求。生物药品易被肠道中酶所分解，给药路径主要是注射用药。对药品制剂均一性、安全性、稳定性、有效性等都有严格要求。生物技术制药全套资料第14页3、检验上特殊性因为生物药品含有特殊生理功效，所以生物药品不但要有理化检验指标，更要有生物活性检验指标，这是生物药品生产开发关键。生物技术制药全套资料第15页二、生物药品质量确保许多生物药品（细胞因子药品）都参加人体机能精细调整，任何性质或数量上偏差，都可能贻误病情甚至造成严重危害，所以必须进行严格质量控制。生物药品质量控制包含以下几项关键点：产品结构和性质判别，纯度、活性、安全性、稳定性和抑制性检验或试验。生物技术制药全套资料第16页任何单一分析方法都无法满足对该类产品检测要求，需综合化学、生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科相关理论和技术。生物技术制药全套资料第17页1、判定方法（1）化学方法：生物药品结构、性质和纯度判别常采取化学方法，包含元素分析、红外、紫外、核磁共振和质谱等方法。（2）生化和生物学方法欲确定生物大分子分子质量、特定空间立体结构和特定生理功效还需要结合生化和生物学方法加以确定。包含电泳方法、受体结合试验、免疫学分析方法等。

生物技术制药全套资料第18页2、安全性评价经过动物试验来判定其安全性。（1）普通安全性要求：无菌、无病毒、无热原、无致敏原等。（2）药代动力学和毒理学研究。（3）致突变、致癌和致畸等遗传毒理性质考查。生物技术制药全套资料第19页三、生物药品分类可按其原料起源、或按其生理功效和临床用途、或按其生物化学性质来分类。通常按其生物化学性质来分类。生物技术制药全套资料第20页（一）按所采取技术伎俩来分1、生物技术药品指采取DNA重组技术、蛋白质工程技术、单克隆抗体技术等当代生物技术研制重组蛋白质类、抗体类和核酸类药品。生物技术制药全套资料第21页（1）重组蛋白质类①细胞因子类：包含干扰素（INF）类、白细胞介素(IL)类、集落刺激因子(CSF)类、生长因子(GF)类、肿瘤坏死因子（TNF）类。②激素类：生长激素、胰岛素等。③治疗心脑血管病活性蛋白质类：包含溶解血栓类、血凝因子类。生物技术制药全套资料第22页④治疗和营养神经活性蛋白质类：包含神经生长因子、神经营养因子、神经营养素等。⑤可溶性细胞因子受体类：包含IL1受体、IL4受体、TNF受体等。⑥导向毒素类：包含IL2导向毒素、IL4导向毒素、单克隆抗体导向毒素等。生物技术制药全套资料第23页（2）抗体药品由分化B淋巴细胞产生能与抗原特异性结合免疫球蛋白。（3）核酸药品（基因药品）分为反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡核苷酸和基因疫苗与基因药品。多用于有害基因诊疗与治疗，阻断有害基因表示。生物技术制药全套资料第24页2、天然生化药品采取生化分离技术直接从动物、植物、微生物和海洋生物中分离提取制备天然药品。生物技术制药全套资料第25页3、微生物药品利用微生物发酵工程技术生产药品。4、合成与部分合成生物药品依据天然药品结构，采取化学合成技术开发生产药品。生物技术制药全套资料第26页（二）按功效和用途来分1、治疗药品用于疾病治疗（疑难病、多发病），如糖尿病、免疫缺点病、心脑血管病、肿瘤等。2、预防药品用于传染病预防，包含各种疫苗、菌苗和类毒素等。生物技术制药全套资料第27页3、诊疗药品用于疾病临床诊疗。包含免疫诊疗试剂、酶诊疗试剂、抗体诊疗试剂、基因诊疗药品和放射性诊疗药品等。生物技术制药全套资料第28页（三）按药品化学本质和生物化学性质来分类1、氨基酸及其衍生物类谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、N-乙酰半胱氨酸、L-二羟基苯丙氨酸等20各种氨基酸及其衍生物，全世界总产量达数百万吨。2、有机酸类乙酸、乳酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸、葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸、D-异抗坏血酸、丙酮酸等。生物技术制药全套资料第29页3、酮醇类乙醇、丙醇、丁醇、甘油等。4、维生素类维生素B2、维生素B12、β-胡萝卜素、维生素C和维生素D前体麦角醇等。生物技术制药全套资料第30页5、酶及辅酶类（1）酶类药品①消化酶类：胰酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。②消炎酶类：溶菌酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等。③心血管疾病治疗酶：弹性蛋白酶、激肽释放酶（扩张血管、降血压）、尿激酶、纤溶酶、溶栓酶等。④抗肿瘤酶：L-天冬氨酸酶（治疗淋巴瘤和白血病）、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶、组氨酸酶等。

生物技术制药全套资料第31页⑤其它酶类SOD：去除自由基、抗衰老，治疗类风湿关节炎和放射病。PEG-腺苷脱氨酶：治疗联合免疫缺点症。RNA酶：用于抗RNA病毒。青霉素酶：治疗青霉素过敏。生物技术制药全套资料第32页（2）辅酶类NAD，NADP（辅酶Ⅱ），FMN（黄素单核苷酸），FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸），辅酶Q10，辅酶A等。生物技术制药全套资料第33页6、脂类（1）磷脂类：卵磷脂、脑磷脂，用于治疗肝病、冠心病和神经衰弱。（2）多价不饱和脂肪酸（PUFA）和前列腺素（PGI2）PUFA：有亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸，用于降血脂、降血压和抗脂肪肝。PGI2：抗血栓、抗动脉粥样硬化。生物技术制药全套资料第34页（3）胆酸类：去氧胆酸（治疗胆囊炎），鹅去氧胆酸（溶胆结石、降低血胆固醇）。（4）固醇类：胆固醇（用于生产人工牛黄），麦角固醇，β-谷固醇（降低血胆固醇）（5）卟啉类：血红素，胆红素等（用于治疗肝炎和肿瘤诊疗）生物技术制药全套资料第35页7、多肽和蛋白质类该类药品多是人体内生理活性因子，包含激素、免疫调整剂和细胞生长因子等。该类药品分子量不一样、性质差异较大。当前已用于临床有19种，即将上市有20各种。生物技术制药全套资料第36页（1）蛋白质类：有血清白蛋白、丙种球蛋白和胰岛素等。（2）多肽类：有激素和免疫调整剂等。生物技术制药全套资料第37页（3）细胞生长因子类：动物细胞分泌含有各种生物活性因子，对人类和动物细胞生长与分化有主要调整作用。有干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）等四大类系列数十种细胞因子。如白细胞介素-2（IL-2）用于治疗肾细胞癌，即将上市有IL-3、IL-6等。α-2a干扰素、α-2b干扰素用于治疗毛细胞性白血病，即将上市有α-干扰素N3、β-1b干扰素、γ-干扰素和γ-1b干扰素等。生物技术制药全套资料第38页8、核酸类及其降解物和衍生物类（1）核酸类：从牛、猪肝脏中提取RNA用于肝癌、肝硬化治疗。免疫RNA（iRNA）用于肿瘤免疫治疗。（2）多聚核苷酸：聚肌苷酸和巯基聚胞苷酸用于抗病毒、抗肿瘤。（3）核苷、核苷酸及其衍生物：ATP、CTP、cAMP、CDP-胆碱等，可将它们经化学修饰后用于治疗肿瘤和抗病毒。生物技术制药全套资料第39页9、糖类活性多糖有抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫功效、升高白细胞和抗炎等作用。有银耳多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖、肝素、透明质酸、壳聚糖、刺参多糖等。生物技术制药全套资料第40页10、生物制品类指从微生物、原虫、动物或人体材料直接制备或用当代生物技术、化学方法制成作为预防、治疗和诊疗特定传染病或其它疾病制剂。生物制品用于各种传染病诊疗、预防和治疗，包含各种疫苗、菌苗和类毒素。生物技术制药全套资料第41页作业：1、阐述生物药品特征。2、阐述生物药品质量确保办法。生物技术制药全套资料第42页第二章基因工程制药第一节基因工程制药概述一、基因工程概念基因工程（Geneengineering）又称DNA重组技术（DNArecombinationtechnology）：是指按人意志，将某一生物体（供体）遗传信息（目标基因）在体外经人工与载体DNA重组，组成重组DNA，然后转入到另一生物体（受体）细胞中，使被引入外源DNA片段（目标基因）在受体细胞内得以表示和遗传。基因工程是能人工定向改造生物遗传性状育种新技术。

生物技术制药全套资料第43页二、基因工程技术优点1、它能从极其复杂各种生物细胞内取得所需目标基因，并将此目标基因在体外进行剪切、拼接、重组，并转入到受体细胞中，从而合成出人们所需新产物。2、它能使带有各种各样遗传信息DNA片段越过不一样生物物种间特异细胞壁而转入到完全不一样生物体内，定向地控制、修饰和改变受体遗传和变异，从而创造出自然界所未有含有新遗传性状生物新种，并增产出数百数千倍人们所需生物新药。生物技术制药全套资料第44页三、在生物技术体系中作用基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生化工程是组成生物技术主体，它们是相互依赖、相辅相成。在这些技术体系中基因工程起着主导作用，因为只有用基因工程改造过生物细胞，才能赋予其它技术以新生命力。生物药品1997年在国际市场销售额有260亿美元，有50各种投放市场，正在临床试验有200各种，其中有100各种很快上市。生物技术制药全套资料第45页第二节基因工程惯用工具酶和克隆载体一、基因工程制药中惯用工具酶基因工程主要特点之一是在体外实施DNA分子切割和重新连接。比如：要取得所需药品目标基因并要将此特定目标基因与载体DNA连接在一起，在很大程度上依赖于一些工具酶。所以，基因工程要得以实施，首先要为体外操作DNA分子提供一系列工具酶。生物技术制药全套资料第46页其中最主要是能接一定核苷酸序列切断DNA分子限制酶，并能把两种DNA片段连接起来DNA连接酶。伴随越来越多酶分子被人们发觉，这类工具酶数量和用途不停增加，许多厂商已能生产并广泛供给各种优质工具酶，这不但大大简化了分子克隆操作，而且拓宽了基因工程研究领域。生物技术制药全套资料第47页（一）限制酶（Restrictionenzymes）限制性核酸内切酶，是一类专一性很强核酸内切酶，专一地识别和作用于DNA分子上特定核苷酸序列，切断DNA双链。对DNA分子上特定核苷酸序列和碱基作用专一性，以及对磷酸二酯键断裂方式上特殊性。生物技术制药全套资料第48页1、限制酶种类（1）Ⅰ型酶：早期提取酶类，是一类复杂多功效酶，在基因工程上应用价值不大。生物技术制药全套资料第49页（2）Ⅱ型酶：相对分子量较小，2万～10万，是简单单功效酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2+。特点：能识别双链DNA上特异核苷酸序列，底物作用专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。自20世纪70年代以来，从几乎全部细菌属、种中都发觉最少一个Ⅱ型限制酶，同一品系菌株中也常有识别不一样序列两种酶。至今已发觉和分离成功Ⅱ型酶大约有500种，其中有些已商品化。生物技术制药全套资料第50页2、限制酶命名是以寄主微生物属名第一个字母（大写）和种名前两个字母（小写）写成斜体字3个字母缩写，菌株名第一个字母以非斜体加在这三个字母后面。若同一菌株里有几个不一样限制酶时，则以罗马数字加以区分。例：HindⅢ限制酶是从流感嗜血杆菌菌株Haemophilus

influenzaed中分离出来第三种限制酶。EcoRⅠ表示从大肠埃氏菌菌株RYB中分离出来第一个限制酶。生物技术制药全套资料第51页属名种名菌株名Haemophilus

influenzae

嗜血流感杆菌株d

HindIII同一菌株中分离出第三个限制性核酸内切酶生物技术制药全套资料第52页3、限制酶特征（1）不一样限制酶能专一地识别不一样特异核苷酸序列（核苷酸序列不一样，序列大小不一样）EcoRⅠ：5‵-GAATTC-3‵HaeⅠ:5‵-(A/T)GGCC(A/T)-3‵AsuⅠ:5‵-GGNCC-3‵EcoRⅡ：5‵-CC(A/T)GG-3‵MboⅠ：5‵-GATC-3‵生物技术制药全套资料第53页（2）各种限制酶识别序列都含有回文结构限制酶所识别序列两条核苷酸链中碱基排列次序是完全相同，即正读与反读都相同，这种结构称回文结构（Palidromicstructure）。例：BamHⅠ识别序列：5‵-GGATCC-3‵3‵-CCTAGG-5‵生物技术制药全套资料第54页EcoRⅠ识别序列：(EcoRⅠ切割位点)5‘-GCT

GAATTC

GAG-3’3‘-CGA

CTTAAG

CTC-5’(EcoRⅠ切割位点)生物技术制药全套资料第55页（3）各种限制酶切割类型是各式各样，切后形成各种粘性或平整末端。①一个是限制酶错位切断DNA双链而形成彼此互补单链末端，称粘性末端（Cohesiveends）如限制酶EcoRⅠ（大多限制酶都是这种切割方式）：5‵-G↓AATTC-3‵→5‵-GAATTC-3‵3‵-CTTAA↑G-5‵3‵-CTTAAG-5‵这种含有粘性末端DNA片段很轻易经过单链区碱基配对而连接在一起，产生线状或环状DNA分子。生物技术制药全套资料第56页EcoRⅠ产生5´粘性末端5’-G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3’-C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C-5’EcoRI37℃5‘-G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3‘-C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

-5’

生物技术制药全套资料第57页Pst

Ⅰ产生3‘粘性末端5‘--G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C--5’Pst

Ⅰ37℃5‘--G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C--5’

生物技术制药全套资料第58页②另一个是限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成双链末端，称为平整末端（Flushends）。如限制酶AluⅠ：5‵-AG↓CT-3‵→5‵-AGCT-3‵3‵-TC↑GA-5‵3‵-TCGA-5‵生物技术制药全套资料第59页PvuII产生平整末端5‘--

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C--5’PvuII37℃5‘--G-C-T-C-A-G-OH

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OH-G-A-C-C-T-C--5’

生物技术制药全套资料第60页依据限制酶识别序列和切点位置，还能够发觉下面两种情况：①识别序列不一样限制酶，切割后有可能产生相同粘性末端：BamHⅠ:5‵-G↓GATCC-3‵→5‵-G5‵-GATCC-3‵3‵-CCTAG↑G-5‵3‵-CCTAG-5‵G-5‵BglⅡ：5‵-A↓GATCT-3‵→5‵-A5‵-GATCT-3‵3‵-TCTAG↑A-5‵3‵-TCTAG-5‵A-5‵MboⅠ：5‵-↓GATC-3‵→5‵-GATC-3‵3‵-CTAG↑-5‵3‵-CTAG-5‵生物技术制药全套资料第61页以上三种限制酶识别不一样核苷酸序列，但切割后产生相同5‵-GATC粘性末端。像这么一类限制酶称同切口限制酶或同裂酶。这类酶DNA酶解片段都可在体外相互重组，在DNA连接酶作用下，能够得到嵌合重组DNA，称为异源二聚体。这种二聚体不再能被原来两种限制酶所识别，有利于得到大量重组DNA分子。

生物技术制药全套资料第62页②起源不一样限制酶其识别序列相同，但因为其切点位置不一样，因而产生切割末端不一样。例：XmzⅠ:5‵-C↓CCGGG-3‵→5‵-C5‵-CCGGG-3‵3‵-GGGCC↑C-5‵3‵-GGGCCC-5‵

SmaⅠ:5‵-CCC↓GGG-3‵→5‵-CCC-3‵5‵-GGG-3‵3‵-GGG↑CCC-5‵3‵-GGG-5‵3‵-CCC-5‵

生物技术制药全套资料第63页（4）在标准条件下，每种限制酶都有严格识别序列。一些限制酶在非标准反应条件下，可能造成酶识别序列特异性发生改变，会严重干扰限制酶在DNA重组中正常应用。所以，全部限制酶反应都应在标准条件下进行。尤其要控制pH值、离子强度、二价离子浓度等反应条件。生物技术制药全套资料第64页在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子浓度、酶与DNA百分比等参数单独或同时发生改变非标准条件下，会造成限制酶识别序列特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶第2活性或星活性。产生第2活性酶常在酶名称右上角加星号“*”。例：EcoRⅠ:5‵-GAATTC-3‵EcoRⅠ*:5‵-AATT-3‵生物技术制药全套资料第65页（二）DNA连接酶能将两段DNA拼接起来酶叫DNA连接酶。这类酶发觉和分离纯化，使两个DNA片段在体外连接形成重组DNA分子成为可能。生物技术制药全套资料第66页DNA连接酶作用催化DNA5‵磷酸和3‵羟基之间形成磷酸二脂键5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPnickPOHnickDNA连接酶生物技术制药全套资料第67页1、T4噬菌体DNA连接酶起源于T4噬菌体感染大肠杆菌，分子量68000u，催化DNA5‵磷酸和3‵羟基之间形成磷酸二脂键。（1）连接带有匹配粘性末端双链DNA分子，也可连接带切口DNA。在PEG低浓度下可促进DNA分子间连接。（2）连接平整末端双链DNA分子，反应速率要比上述粘性末端连接慢得多。但在单价阳离子和低浓度PEG存在条件下可大大提升平整末端连接速率。生物技术制药全套资料第68页T4-DNA连接酶催化粘性末端连接5’-G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3’-C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C-5’T4-DNA连接酶5‘-G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3‘-C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

-5’

生物技术制药全套资料第69页T4-DNA连接酶催化平整末端连接5‘--

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C--5’T4-DNA连接酶5‘--G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C--5’

PEG生物技术制药全套资料第70页2、大肠杆菌DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶可催化相互匹配粘性末端5‵突出端与3‵末端双链DNA之间形成磷酸二酯键，但需NAD作辅助因子。该酶普通不能催化平整末端双链DNA间连接，但在PEG或Ficoll(聚蔗糖)存在下也能催化平整末端连接。生物技术制药全套资料第71页（三）DNA聚合酶（DNApolymerase）是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤一类酶。在基因工程操作中用于DNA体外合成反应。这类酶作用时大多需要DNA模板并优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。另有一个聚合酶，即反转录酶，是依赖于RNADNA聚合酶，可优先拷贝RNA。生物技术制药全套资料第72页1、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ分子量109000u，由一条多肽链组成，约有1000个氨基酸，酶分子中含有一个双硫键和一个巯基，还含锌离子，基本是一个椭圆形结构，是一个多功效酶。生物技术制药全套资料第73页（1）该酶含有三种活力：①5‵→3‵聚合酶活力：底物为单链DNA模板及带3‵羟基DNA引物，聚合脱氧核苷酸，使之逐一接到引物上。②5‵→3‵外切酶活力：底物是双链DNA或RNA﹕DNA杂交体，从5‵端降解DNA或RNA。③3‵→5‵外切核酸酶活力：底物是带有3‵羟基端双链DNA或单链DNA，从3‵羟基端逐一切除核苷酸降解DNA。5‵—GATTCGTAACGGTA-OH-3‵3‵—CTAAGCATTGCCAT—5‵生物技术制药全套资料第74页大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ作用5‘→3‘DNA聚合酶活性3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OHDNA聚合酶Ⅰ5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH生物技术制药全套资料第75页（2）该酶主要用途是采取切口平移法，以放射性脱氧核苷酸置换原来dNTP标识DNA，从而制作DNA探针。另外，用于修补DNA缺损部位空隙。5‵-GATT-3‵5‵-CGTAACGCCA-3‵3‵-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5‵5‵-GATTCGTAACTCG-3‵5‵-CA-3‵3‵-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5‵生物技术制药全套资料第76页2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）Klenow酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理，取得N端三分之二大肽段，即为Klenow酶。Klenow酶仍拥有5‘→3‘DNA聚合酶活性和3‘→5‘核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘核酸外切酶活性。生物技术制药全套资料第77页Klenow酶基本作用：补平由核酸内切酶产生5‘粘性末端DNA片段同位素末端标识cDNA第二链合成双脱氧末端终止法测定DNA序列生物技术制药全套资料第78页Klenow酶作用一补平由核酸内切酶产生5‘粘性末端

5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

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生物技术制药全套资料第79页Klenow酶作用二

DNA片段同位素末端标识5‘…G-C-T-G-OH

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C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’

生物技术制药全套资料第80页3、TaqDNA聚合酶是从极度嗜热水生栖热菌（Thermasaquaticus）中分离纯化而来，是一个耐热聚合酶，分子量6500u。当前生产并出售是AmpliTaqTMDNA聚合酶。该酶含有5‵→3‵聚合酶活力和依赖于聚合作用5‵→3‵外切酶活力。该酶最正确作用温度75~80℃，为防止引物在模板上解离，往往要在低于最适温度条件下起始聚合反应。该酶可用于对DNA进行测序，但主要用于PCR（聚合酶链式反应），对DNA分子特定序列（目标基因）进行体外扩增。生物技术制药全套资料第81页4、T4噬菌体DNA聚合酶起源于T4噬菌体感染大肠杆菌，含有5‵→3‵聚合酶活力和3‵→5‵外切酶活力。作用：①补平和标识限制酶消化DNA后产生3‵凹端。5‵-G-3‵5‵-GGATC-3‵3‵-CCTAG-5‵3‵-CCTAG-5‵②对带有3‵突出端DNA分子进行末端标识。③标识用作探针DNA片段。④将双链DNA末端转化成平端。生物技术制药全套资料第82页T4-DNA聚合酶作用一切平由核酸内切酶产生3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G

…3’3‘

…

C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’T4-DNA聚合酶5‘

…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C

…5’生物技术制药全套资料第83页T4-DNA聚合酶作用二

DNA片段同位素末端标识5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApol5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘

T4-DNApolMg2+

a-32P-dNTP5‘

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘

生物技术制药全套资料第84页5、经修饰T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）起源于T7噬菌体感染大肠杆菌，含有较强连续5‵→3‵聚合酶活力和3‵→5‵外切酶活力。它所催化合成DNA平均长度要比其它DNA聚合酶大得多，可用于长段模板上引物延伸反应。经化学修饰T7噬菌体DNA聚合酶商品名为测序酶，去除了3‵→5‵外切酶活力，保持了5‵→3‵聚合酶活力，它连续合成能力很强。主要用于Sanger双脱氧末端终止法对长段DNA分子测序。现又用基因工程伎俩生产出一个改进测序酶2.0版，完全丧失了外切酶活力。

生物技术制药全套资料第85页6、反转录酶该酶为依赖于RNADNA聚合酶，起源于鼠或禽反转录病毒。该酶主要以mRNA为模板转录合成互补双链cDNA，也可用于制备杂交用探针和标识带5‵突出端DNA片段。生物技术制药全套资料第86页反转录酶作用一以mRNA为模板反转录合成cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反转录酶Mg2+dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTT3’cDNA生物技术制药全套资料第87页反转录酶作用二双向外切DNA-RNA杂合链中RNA链3’RNA5’DNA3’5’反转录酶3’RNA5’DNA3’5’反转录酶5’DNA3’生物技术制药全套资料第88页（四）核酸酶1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）核酸外切酶VII双向外切DNA单链5’3’5’3’ExoVII5’5’3’3’生物技术制药全套资料第89页2、双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）核酸外切酶III特异性地从3‘端外切双链DNA5’3’3’5’ExoIIIMg2+5’5’3’3’生物技术制药全套资料第90页3、双链核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）l核酸外切酶特异性地从5‘端外切双链DNA5’3’3’5’lExoMg2+3’3’5’5’生物技术制药全套资料第91页4、单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶基本特征降解单链DNA速度比降解双链DNA快75000倍反应必需有Zn2+最适pH范围为4.0-4.3需要NaCl10-300mMol降解单链DNA速度比降解单链RNA快7倍生物技术制药全套资料第92页S1核酸酶基本反应一内切单链DNA或RNA，产生带5‘磷酸单核苷酸。5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs生物技术制药全套资料第93页S1核酸酶基本反应二内切带缺口或缺刻双链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘

nick5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A…5‘

gapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘

生物技术制药全套资料第94页5、单链内切双链外切核酸酶：Bal31核酸酶主要是3‘核酸外切酶活力，同时也含有DNA内切酶活力。可从线状DNA两条链3‘端快速去除单核苷酸，随即在形成互补单链上进行迟缓内切酶降解。DNAorRNABal315‘dNMPs或5‘NMPsBal31Bal31生物技术制药全套资料第95页（五）核酸修饰酶1、末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）TdT基本特征：不需要模板DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。作用底物：带3‘OH单链DNA或双链DNA。5‘pOH3‘

3‘HOp5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOp5‘

AAAAAAAAAAAA

OH3‘

生物技术制药全套资料第96页TdT基本作用：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+,

dATP5‘pp5‘

AAAAAAAAAA

OH3‘

3‘HO

AAAAAAAAAAA5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+,

dATP5‘pp5‘

AAAAAAAAAA

OH3‘

3‘HO

AAAAAAAAAAA生物技术制药全套资料第97页2、碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺碱性磷酸单酯酶（CIP）,特异性强；来自大肠杆菌碱性磷酸单酯酶（BAP），耐热；作用：催化去除单链或双链DNA或RNA分子中5‘p，即脱磷酸作用，预防DNA片段本身环化。DNAorRNA5‘pOH3‘

5‘HOOH3‘

5‘pppdN5‘pppNBAP

/CIP5‘HOdN5‘HON生物技术制药全套资料第98页3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP基本作用：在DNA、RNA5‘-OH上加磷酸用于DNA探针末端同位素标识。5‘HO3‘HOOH3‘

OH5‘

T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）OH3‘

3‘HO5‘

pp

5‘

生物技术制药全套资料第99页二、基因工程惯用克隆载体基因工程一个主要步骤是目标基因转运载体（Vector）之设计和利用。因为目标基因（外源DNA）普通难以进入不一样种属宿主细胞中，即使能单独进入也不能进行复制增殖和表示，它必须与含有自我复制能力DNA载体共价结合后才能被复制和表示。生物技术制药全套资料第100页这种在细胞内含有能进行自我复制独立DNA分子作为外源DNA片段运载体，简称基因载体，又称分子克隆载体或无性繁殖载体。功效特点：①能自行自我复制。②轻易导入宿主细胞。生物技术制药全套资料第101页（一）基因载体特征理想基因载体应具备以下特征：①要有复制子（Replicom）功效，且复制起始区中没有限制酶酶切位点。②要含有强开启子，要有能促进外源DNA高水平表示调控区。③要有各种限制酶单一切点，以适合用于各种限制酶产生DNA片段插入。④含有两种以上易被检测选择性遗传标识，作为对重组与非重组转化体选择标识。生物技术制药全套资料第102页⑤载体DNA分子量要尽可能小，以利于容纳较长区段外源DNA片段。⑥应属于松弛型复制，能在氯霉素存在下扩增其拷贝数。⑦从安全防治考虑，载体应为非传递性，有较小宿主范围，不为传递性载体所诱导。生物技术制药全套资料第103页要到达上述要求，必须对天然存在原始载体进行改造并构建成理想载体：①引入强开启子。②引入选择性标识基因。③切除大部分多出序列段，以提升容纳外源DNA片段能力。④引入由各种限制酶单一识别序列组成多克隆位点。⑤引入各种用途辅助序列。生物技术制药全套资料第104页（二）惯用基因载体1、质粒载体质粒（Plasnid）是一些存在于微生物细胞内染色体外闭合环状双链小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传辅助性遗传单位，是基因工程一类主要分子克隆载体。生物技术制药全套资料第105页（1）pBR322

分子量2.6×106u，4.36kb。①由pMBI改造而成，引入了Tetr(抗四环素)和Ampr(抗氨苄青霉素)两个抗药标识基因，去除了大部分非必须序列，大小仅4.36kb。该质粒有32个限制酶切位点，Tetr内有BamAⅠ等10个酶切位点，Ampr基因内有Pst

Ⅰ等6个限制酶切位点，十分有利于检出重组转化子。pBR322质粒上从复制起点到Tetr基因间还有一个较长非必须区域，分子量相对较大。

生物技术制药全套资料第106页②pAT153载体：在1644~2349位点之间切除了HaeⅡ片段，去除了705bp，包含接合转移相关序列。③pBR327载体：切除了1442~2502非必须区段而成，长仅3.27kb，拷贝数增加2~4倍生物技术制药全套资料第107页（2）、PUC系列载体①PUC18、PUC19质粒载体，是2.7kb小型载体。含有Ampr(抗氨苄青霉素)基因，复制原点和LacZ基因。在LacZ基因内有各种限制酶识别位点组成多克隆位点。在对应宿主（LacZ–）中可出现α互补（合成β-半乳糖苷酶）。生物技术制药全套资料第108页pUC质粒载体

(1)来自pBR322质粒复制起点(ori)；(2)氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，但它DNA核苷酸序列已经发生了改变，不再含有原来限制酶单识别位点。(3)大肠杆菌β-半乳糖苷酶开启子以及编码该酶氨基端α-肽链DNA序列,此结构特称为lacZ基因。(4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ基因中靠近5’端，内含十几个单一限制性内切酶识别切割位点，使含有不一样粘端目标DNA片段可方便地定向插入载体中。生物技术制药全套资料第109页②PUC118、PUC119分别来自PUC18、PUC19，不一样是它们均带有M13丝状噬菌体DNA合成起始、终止及DNA包装进入噬菌体颗粒所必需序列。生物技术制药全套资料第110页2、λ噬菌体载体人们对λ噬菌体已进行了长达几十年研究，发觉其DNA失去占总量20%序列时仍不失活，这部分缺失DNA空间恰好可作为运载外源DNA之用。λ噬菌体基因组为双链线状DNA，分子量30.8×106u，含有4.85kb，含有50个基因，其中只有50%是必需。经改造，消除基因组必需区域中多出限制酶切位点，去除λDNA中一些非必需区段。生物技术制药全套资料第111页①插入型载体：λDNA中缺失部分为非必需区段，只有一个可供外源DNA插入限制酶切位点（单切位点）。②替换型载体：在λDNA可替换片段两端含有两个限制酶切位点，酶切后替换片段，由外源DNA片段所取代。生物技术制药全套资料第112页3、M13噬菌体载体该载体引入有LacZ基因，该基因内有13个不一样酶切位点组成多克隆位点，可供插入各种酶切DNA片段。可与宿主（LacZ–）形成α互补，产生有活性β-半乳糖苷酶。但当在多克隆位点插入外源DNA时，α互补消失。生物技术制药全套资料第113页4、粘粒（Cosmid）是一个有λ噬菌体粘性末端杂种质粒，由λDNAcos区段与质粒DNA重组构建而成。cos序列：将DNA包装到λ噬菌体颗粒必需序列。粘粒是为克隆和增殖较大区段基因组DNA而设计，是组建真核生物基因文库和从各种生物中分离基因有效伎俩。生物技术制药全套资料第114页粘粒大小为4~7kb，惯用为5kb。噬菌体颗粒容纳最大DNA达52kb，所以粘粒可克隆大小为35~45kbDNA片段。粘粒由质粒改造而来，通常带有1个拷贝cosDNA序列，1个复制起点和1个抗药标识基因（Ampr）。生物技术制药全套资料第115页5、动植物病毒用于克隆外源基因，导入动植物细胞为宿主细胞。生物技术制药全套资料第116页作业：1、名词解释基因工程，限制酶，连接酶，同裂酶，限制酶星活性，基因载体，粘粒。2、基因工程技术优点。3、限制酶有哪些特征？4、TaqDNA聚合酶有哪些特征和用途？5、基因载体有哪些特征？6、怎样将天然原始载体改造成理想基因载体？生物技术制药全套资料第117页第三节基因工程药品生产基本过程基因工程技术制药基本过程：①目标基因制取a、从供体生物分离纯化取得含目标基因DNA。b、供体DNA分子酶切、目标基因判别和分离。生物技术制药全套资料第118页②目标基因与克隆载体体外重组，构建重组克隆载体。用限制性内切酶和连接酶将目标基因拼接到适当质粒载体或噬菌体载体中。③重组克隆载体导入宿主细胞转化与转导，构建成基因工程细胞株。④含目标基因工程细胞株筛选、判定与分析。生物技术制药全套资料第119页⑤目标基因在宿主细胞中高效表示。包含：工程细胞株大规模培养最正确参数确实定，新型生物反应器研制与应用，生物传感器等一系列仪表设计与应用，应用计算机对发酵过程进行优化控制等。⑥产物分离纯化高效分离介质及装置开发，分离纯化工艺选择与优化控制以及高纯度产品制备技术。⑦产品检验及安全性评价生物技术制药全套资料第120页一、目标基因制取一个细菌DNA上有数千个基因，高等动植物有几十万个基因，怎样从成千上万个基因海洋中取得某个特定基因。分子生物学家确定了3种主要方法，构建基因文库法、反转录法和PCR法。生物技术制药全套资料第121页（一）构建基因文库法分离目标基因构建基因文库法又称鸟枪法或散弹射击法：用特定限制性内切酶将供体DNA切成许多片段（20~24kb），即用能产生互补粘性末端限制性内切酶切开，可能取得含有目标基因DNA片段。生物技术制药全套资料第122页1、基本概念基因文库：将供体生物DNA用限制酶切成许多片段，在连接酶作用下分别与克隆载体进行体外重组，这种含有供体生物全部不一样基因重组克隆载体总体称供体生物基因文库。生物技术制药全套资料第123页2、基本步骤①首先从含有目标基因供体生物细胞或组织中提纯取得高质量基因组DNA。②用特定限制性内切酶将含有目标基因供体基因组DNA切割成许多片段。③用能产生互补粘性末端限制性内切酶将载体（噬菌体或质粒）DNA切开并去除其中填充片段。生物技术制药全套资料第124页④用专一性强DNA连接酶将供体DNA片段分别与载体DNA连接（供体DNA片段克隆到载体中）。⑤经包装繁殖而产生重组噬菌体克隆（DNA重组体），建成供体基因组DNA文库组员。⑥当制备克隆数多到足以把某种供体生物全部基因都包含在内时，这些克隆总体就称为该生物基因文库。生物技术制药全套资料第125页⑦有了基因文库，在分离带有目标基因DNA重组体时就能够从文库中筛选而无须重复地进行全部操作。可采取放射性核酸探针杂交筛选含目标基因重组克隆载体。若已知目标基因核苷酸序列，可用DNA序列分析法筛选含目标基因重组体。将DNA重组体转入宿主细胞，经过工程细胞株培养，检测有没有目标产物来筛选出含有目标基因重组体。生物技术制药全套资料第126页（二）反转录法（cDNA基因文库法）1、基本原理：因为真核生物基因大多为断裂基因，含有非编码间隔区（内含子，Intron），在原核生物受体中无法正常表示，必须设法消去内含子。mRNA是在供体生物细胞内已经转录加工过RNA，是无内含子遗传密码携带者。在反转录酶作用下，以mRNA为模板反转录合成互补DNA（cDNA），再加上接头，即可与载体DNA连接构建成重组克隆载体，从而建成供体生物cDNA基因文库，再从中筛选带有目标基因DNA重组体。生物技术制药全套资料第127页cDNA基因文库：以供体生物总mRNA为模板，在反转录酶作用下合成核苷酸序列互补DNA（cDNA），将全部cDNA分别与克隆载体进行体外重组，这些含有供体生物全部不一样基因重组克隆载体总体称供体生物cDNA基因文库。生物技术制药全套资料第128页2、基本步骤①从供体生物细胞或组织中提取纯化得总RNA，其中含mRNA1~5%，其核苷酸序列由几百到几千个核苷酸组成。生物技术制药全套资料第129页②从总RNA中分离纯化出mRNA原理：亲和层析法，因为真核细胞中mRNA3‵端常含有一多聚腺苷酸[poly(A)]组成末端（20~250个腺苷酸），易吸附于寡聚脱氧胸苷酸[Oligo(dT)]-纤维素上。方法：含有总RNA高盐缓冲液流经[Oligo(dT)]-纤维素柱时，mRNA被特异地结合在柱上。当逐步降低盐浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来，经过两次[Oligo(dT)]-纤维素柱后，可得到高纯度mRNA。生物技术制药全套资料第130页③cDNA合成Ⅰ、cDNA第一链合成mRNA带有3‵-poly(A)末端，可用Oligo(dT)作为引物，在反转录酶作用下以mRNA为模板合成cDNA第一链（普通带有发夹结构）。普通一次可拷贝5~30%mRNA。

mRNA5‵-GCCTACGGATCCTACGAAAAAAA-3‵cDNAATGCTTTTTTT-5‵

生物技术制药全套资料第131页Ⅱ、cDNA第二链合成先用碱解或RNaseH酶解除去cDNA-mRNA杂交链中mRNA链。然后以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶Ⅰ作用下合成第二链（从第一链3‵末端发夹结构开始合成第二链）。再用专一性强核酸酶S1切去发夹结构，得双链cDNA。双链cDNA可用凝胶电泳测定其大小。生物技术制药全套资料第132页④cDNA克隆——构建DNA重组体即cDNA基因文库建立。经前3步，从所取得mRNA分子集群对应合成cDNA分子集群。将合成各双链cDNA分别与载体DNA进行体外重组，构建成cDNA重组体，即cDNA基因文库。生物技术制药全套资料第133页Ⅰ、从cDNA基因文库筛选带有目标基因cDNA重组体。Ⅱ、或经包装后转染到宿主细胞，得到一群含cDNA重组体工程细胞株，再从中筛选含有目标基因工程菌。用于cDNA体外重组载体有噬菌体和质粒两类，当cDNA片段小于10kb时用质粒载体，大于10kb时用噬菌体载体。最好用含有操纵子表示型载体，有利于含有目标基因cDNA重组体筛选。生物技术制药全套资料第134页⑤cDNA文库判定Ⅰ、依据表示型克隆（cDNA重组体）表型筛选a、抗性基因失活法，抑菌圈法。b、菌落或噬菌斑颜色改变法。c、α-互补现象消失法。Ⅱ、深入判定方法有凝胶电泳、分子杂交或DNA序列测定法（在已知目标基因分子量大小和核苷酸序列条件下）。生物技术制药全套资料第135页⑥含目标基因cDNA重组体筛选a、核酸探针杂交法：人工合成与目标产物对应单链寡聚核苷酸为探针，从cDNA文库中筛选含目标基因cDNA克隆。b、DNA序列分析法。c、免疫反应判定法：用某目标产物抗体寻找对应特异cDNA克隆。d、cDNA克隆同胞选择法：将cDNA基因文库分成含10~100克隆亚库，再从各亚库中筛选。生物技术制药全套资料第136页生物技术制药全套资料第137页cDNA基因重组转化核酸探针cDNA文库生物技术制药全套资料第138页（三）化学合成法用化学合成法合成目标基因DNA片段。先决条件：必须知道目标基因核苷酸序列，或知道目标蛋白质氨基酸次序，再推导出DNA碱基序列。生物技术制药全套资料第139页①先合成不一样部位双链寡聚核苷酸短片段。②经退火成为两端形成粘性末端DNA双链片段。③再按正确次序连接成较长完整基因DNA片段。生物技术制药全套资料第140页（四）RT-PCR法合成目标cDNA反转录-聚合酶链式反应合成目标基因cDNA，是近年来发展起来一个获取真核生物目标基因cDNA简便、快捷而高效酶促合成法。该法是以目标基因mRNA为模板，用反转录酶先合成与其互补DNA（cDNA）第一链，再进而酶促合成双链DNA。生物技术制药全套资料第141页该法前提是首先取得目标基因对应mRNA。在真核生物总RNA中rRNA占80~85%，tRNA占10~15%，mRNA占1~5%，而且mRNA种类繁多（1~3万种），核苷酸序列各不相同，大小从数百至数千碱基不等。所以要从中分离纯化目标mRNA，其难度不亚于分离目标基因。生物技术制药全套资料第142页但人们发觉，从一些特定型分化细胞分离细胞质中，编码某特种蛋白质目标mRNA占总mRNA50~90%。称为高丰度mRNA。如网织红细胞中珠蛋白mRNA，鸡输卵管卵清蛋白mRNA，淋巴细胞中免疫球蛋白mRNA，眼球晶体蛋白等mRNA均为高丰度mRNA。生物技术制药全套资料第143页1、RF-PCR技术合成目标基因cDNA普通程序①从真核生物细胞或组织中提取纯化总RNA。②在Oligo(dT)为引物引导下，以总RNA中总mRNA为模板，在反转录酶作用下，合成总cDNA第一链。③以两个引物所结合单链目标cDNA(靶序列)为模板，大量合成双链目标cDNA。生物技术制药全套资料第144页2、PCR技术体外扩增DNA聚合酶链式反应体外扩增DNA；聚合酶链式反应（Polymerosechainreaction）技术，简称PCR技术，是一个用于在体外扩增位于两段已知序列之间DNA区段分子生物学技术。应用该技术可在很短时间内得到数百万个特异DNA序列拷贝。当前该技术已在医学诊疗、分子克隆和DNA分析中得到广泛应用。生物技术制药全套资料第145页（1）PCR技术基本程序①变性：首先使双链DNA在反应液中经热变性（94~95℃）而分开成单链（或使反转录合成cDNA:RNA杂交链分开成单链）。②退火：然后降温至40~60℃，在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链DNA配对结合。③延伸：再在中温72℃下利用TaqDNA聚合酶聚合活性和热稳定性进行聚合（延伸）反应。

生物技术制药全套资料第146页

变性94~95℃

退火40~60℃延伸72℃生物技术制药全套资料第147页PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火生物技术制药全套资料第148页如此，每经过一次变性，退火和延伸三个步骤为一个循环，经过30次重复循环后，所扩增特定DNA序列数量可增至106倍。生物技术制药全套资料第149页（2）PCR反应体系组成含靶序列（目标DNA序列）DNA，寡聚核苷酸（PCR引物），TaqDNA聚合酶，四种脱氧核苷三磷酸（dNTP），PCR缓冲液。生物技术制药全套资料第150页①含靶序列DNA（模板）含有靶序列DNA加入PCR反应体系时，a、能够是单链或双链DNA形式存在，或是cDNA:RNA杂交链。b、闭环靶序列DNA扩增比线性DNA略低，最好先将其线状化。c、分子量极高基因组DNA为模板DNA时，若先用切点罕见限制酶（SalⅠ或NotⅠ）进行消化，则扩增效果更加好。d、模板DNA用量依靶序列DNA在模板DNA中含量而异。生物技术制药全套资料第151页②寡聚核苷酸（PCR引物）a、作为PCR引物寡核苷酸最适长度为20~24个核苷酸，尽可能选择碱基随机分布序列，防止因较长互补序列而形成引物二聚体或发夹结构。生物技术制药全套资料第152页b、为了使扩增DNA产物能高效地插入带有互补末端载体中，在设计引物时，常使其5‵端带一限制酶特异酶切位点序列，使扩增产物既含有目标序列，两侧又带有限制酶切位点。c、引物在反应液中浓度是1μMol/L，足以满足完成30个循环扩增反应。若引物不足PCR效率低，浓度太高将造成非特异性扩增。生物技术制药全套资料第153页③TaqDNA聚合酶当前用于PCR技术有两种商品TaqDNA聚合酶供给。一个是从水生栖热菌中提纯天然酶，另一个是由E.coli合成基因工程酶（AmpliTapTM），都有5‵→3‵聚合酶活力和5‵→3‵外切酶活力。加酶量不宜过多或过少，在100μl反应体系中，用酶量1～5u。

生物技术制药全套资料第154页④四种dNTP四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）在PCR反应液中通常每种浓度为50~200μMol/L，浓度过大将造成在DNA复制过程中核苷酸错误掺入。生物技术制药全套资料第155页⑤PCR缓冲液PCR反应液所用标准缓冲液含有50mMol/LKCl，10mMolTris-HCl（pH8.3），1.5mMol/LMgCl2，其中Mg2+存在至关主要。所制备模板DNA中不应含有较高浓度EDTA或带负电基团，以免影响到Mg2+有效浓度。当在72℃反应时，反应体系pH值将下降至靠近7.2，为聚合酶最适pH值。生物技术制药全套资料第156页3、RT-PCR技术合成目标基因cDNA反转录-聚合酶链式反应合成目标基因cDNA基本步骤：①从真核生物组织或细胞中提取纯化总RNA。②以Oligo(dT)为引物，以总RNA中总mRNA为模板，在反转录酶作用下合成互补总cDNA。生物技术制药全套资料第157页③变性：升温至94~95℃加热5min，使总mRNA﹕cDNA杂交链因为热变性而分开成单链。④退火：降温至40~60℃，加入“上游”寡核苷酸引物和“下游”寡核苷酸引物，进行退火，使引物与单链mRNA和cDNA结合。引物应是与目标基因3‵端互补核苷酸序列。⑤延伸：升至中温72℃，在反应体系中（扩增缓冲液）加入Taq聚合酶和四种dNTP，分别以目标mRNA和目标cDNA单链为模板进行聚合（延伸）反应。如此按变性、退火、延伸进行约30次重复循环，得到目标cDNA大量拷贝（106倍）。生物技术制药全套资料第158页⑥从反应液中分离提取出双链目标cDNA扩增产物，经过凝胶电泳分离出双链目标cDNA扩增产物，并经过DNA序列测定进行分析判别。⑦目标cDNA与载体DNA进行体外重组，构建重组克隆载体。⑧带有目标cDNA重组载体转导进入宿主细胞。生物技术制药全套资料第159页作业：1、名词解释基因文库，cDNA基因文库，PCR技术2、简述基因文库构建基本步骤。3、简述cDNA基因文库构建基本步骤。4、PCR技术基本程序。5、简述RT-PCR技术合成目标基因基本步骤。生物技术制药全套资料第160页二、目标基因与克隆载体体外重组DNA体外重组是将目标基因DNA用DNA连接酶在体外连接到适当载体DNA上。这种重新组合DNA称为重组DNA，简称重组体。生物技术制药全套资料第161页（一）目标基因DNA与质粒DNA连接质粒载体适合克隆较小（<10kb）而又结构简单目标基因，比其它载体更加好。优点：含有稳妥可靠和操作简便特点。生物技术制药全套资料第162页依据目标基因DNA片段与质粒载体DNA上限制酶酶切位点性质，可选择以下几个方法来进行连接。1、粘端连接法：用同一个酶或能产生相同粘性末端酶切开，目标基因DNA片段与质粒载体DNA会产生相同互补粘性末端，很轻易连接。生物技术制药全套资料第163页（1）定向克隆法当用两种不一样限制酶（如用BamHⅠ和HindⅢ）消化同一DNA基因组时，切下来同一DNA片段带有非互补突出末端，这么供体DNA片段只能以一个方向很轻易地连接到一样用BamHⅠ和HindⅢ进行消化而产生相匹配粘性末端载体DNA当中。优点：该法优点是因为载体DNA片段两突出末端不互补，不能本身环化，但与目标基因DNA片段定向重组率却较高。生物技术制药全套资料第164页两种限制酶酶切位点连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体生物技术制药全套资料第165页操作应注意关键点：①利用限制酶对DNA进行消化时，应按照与酶一起提供说明书进行操作。②尽可能采取同时提供缓冲液。当用两种或两种以上限制性酶切割DNA时，若这些酶所要求缓冲液有所不一样，则可使用谷氨酸钾缓冲液（KGB），可使各种限制酶活力到达最高。③酶作用后，应经过凝胶电泳或凝胶层析纯化载体DNA大片段，方便与切下来小片段分开。④防止选取在克隆位点上有酶切位点。生物技术制药全套资料第166页（2）粘性末端连接法用一个限制酶酶切，会产生带有相同粘性末端外源目标DNA片段，必须与用同一个限制酶消化而形成含有相同匹配末端质粒载体相连接。特点：质粒载体DNA和外源DNA片段都可能发生本身环化，也有可能形成串联寡聚物。

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生物技术制药全套资料第167页BamHⅠ切割反应

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