荧光定量PCR基础原理

荧光定量PCR基础原理1/39○PCR扩增理论模式○RealtimePCR理论基础荧光定量PCR基础原理2/39PCR是将样本中微量DNA模版放大来研究模版特征。伴随研究深入，要了解样本中基因表示模式与疾病关系，就需要了解标本中DNA原始拷贝数。荧光定量PCR基础原理3/39因为各种环境原因复杂相互作用，不一样PCR反应体系进入平台期时间和平台期高低都有很大改变，即使是重复试验，各种条件基本一致，最终得到DNA拷贝数也往往不一样。所以经过PCR扩增DNA产物量不能反应起始模板量真实情况。经过凝胶电泳EB染色或者同位素标识只能定量PCR终产物量，而不能定量起始DNA模版拷贝数。荧光定量PCR基础原理4/39实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术是一个在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终经过标准曲线对未知模板进行定量分析方法。实时荧光定量PCR技术不但实现了对DNA模板定量，而且含有灵敏度高，特异性和可靠性强，重复性好，自动化程度高、无污染性等突出优势，所以被公认为当今世界用于临床最先进核酸分子诊疗技术。荧光定量PCR基础原理5/39PCR扩增理论模式PCR中，伴随扩增周期增加，模板以指数方式进行扩增。PCR理论方程：N=N0×(1+E)nN:扩增子数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环数此公式仅在指数扩增期（20-30个循环）内成立。荧光定量PCR基础原理6/39PCR分期——“S”形曲线对PCR扩增过程详细分析表明，PCR扩增曲线可被分为三个经典时期：早期背景扩增期、中期指数扩增期（或对数线形扩增期），以及晚期平台期荧光定量PCR基础原理7/39理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增加，但实际PCR扩增曲线并不是标准指数曲线，而是S形曲线；因为伴随PCR循环数增加，扩增规模快速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐步不敷需求，PCR效率降低，产物生成速度逐步减缓，最终进入平台期。荧光定量PCR基础原理8/39两种定量方法荧光定量PCR基础原理9/39荧光定量PCR基础原理10/39两种定量方法终点定量起点定量无规律对数期分析：平行性好终点产物数量：误差大拐点产物数量：重现性好，误差小影响原因多扩增效率恒定，标准曲线呈线性起始DNA量，更具意义重现性好，误差小扩增效率恒定，标准曲线呈线性荧光定量PCR基础原理11/39普通PCR技术检测模式普通PCR仪器扩增，约2.5小时琼脂糖凝胶电泳，约1小时EB染色，约20分钟紫外成像阴性阳性样品检测结果无法定量荧光定量PCR基础原理12/39实时荧光定量PCR检测模式荧光定量PCR仪器扩增，约2小时检测过程有实时监测数据光滑S型指数曲线，阳性无S型指数曲线，阴性荧光定量PCR基础原理13/39实时荧光定量PCR检测模式需绝对定量时四个已知浓度标准品，得到标准曲线系统即可自动计算出未知样品浓度荧光定量PCR基础原理14/39阴性结果曲线图示荧光定量PCR基础原理15/39阳性结果曲线图示荧光定量PCR基础原理16/39实时荧光定量PCR基本原理在常规PCR反应基础上，加入荧光染料或荧光标识探针，伴随PCR反应进行，PCR产物不段累积，荧光信号强度等比增强。每经过一个循环，搜集一个荧光强度信号，这么经过荧光强度改变监测产物量改变，从而得到一条荧光扩增曲线。经过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号实时检测，从而对起始模板定量及定性分析。荧光定量PCR基础原理17/39荧光扩增曲线分三阶段荧光背景信号，荧光信号指数扩增阶段，平台期荧光背景信号阶段：该时期扩增荧光信号被背景信号所掩盖，扩增产物量无法判断。平台期：扩增产物不再呈指数增加，PCR终产物量与起始模板量无线性关系，无法计算起始DNA拷贝数。荧光信号指数扩增阶段：该时期，PCR产物量对数值与起始模板量呈线性关系，所以选择这一阶段进行定量分析。引入两个概念：荧光阈值和Ct值。荧光定量PCR基础原理18/39实时定量PCR两个主要概念（1）荧光域值（

threshold）：荧光扩增曲线上人为设定一个值，以PCR反应前15

个循环荧光信号作为荧光本底信号，普通荧光域值定义为3-15个循环荧光信号标准偏差10

倍。阈值=基线信号标准偏差x10荧光定量PCR基础原理19/39实时定量PCR两个主要概念(2)Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增加阶段拐点所对应循环次数。在实际操作中，Ct值也就是每个反应管内荧光信号抵达设定域值循环次数,可见Ct值取决于阈值。

荧光定量PCR基础原理20/39基线阈值Ct值荧光定量PCR基础原理21/39Ct值∝DNA起始浓度Ct值与模板DNA起始拷贝数对数存在线性关系。起始拷贝数越多，到达荧光阈值Ct值越小。Rn=RB+X0(1+E)nRs总信号=本底信号+分子数量×单位信号强度Rn：第n个循环时总信号RB：本底RS：单位信号强度X0：起始DNA数目E：PCR效率荧光定量PCR基础原理22/39Rn=RB+X0(1+E)nRs当循环次数n=CT值时：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即CT=-klgX0+b（线性方程）荧光定量PCR基础原理23/39定量方法利用已知起始拷贝数标准品做出标准曲线，纵坐标代表起始拷贝数对数，横坐标代表Ct值。所以，只要取得未知样品Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。荧光定量PCR基础原理24/39RealtimePCR化学原理双链DNA结合染料染色-非特异性检测–SYBR®GreenI–溴乙锭(EthidiumBromide)探针标识-特异性检测–TaqManTM–TaqManMGB–Dual-oligoFRETpairs–分子信标(Molecularbeacons)–ScorpionsTM/AmplifluorTM荧光定量PCR基础原理25/39SYBR

Green

I荧光染料作用原理SYBR

Green

I是一个只与双链DNA小沟结合荧光染料，可与全部各种序列双链DNA分子结合。当它与DNA双链结合时，发出荧光；变性时，DNA双链分开时，荧光信号急剧减弱。在延伸结束阶段，采集荧光信号。所以，在一个体系内，信号强度与DNA双链总数目成正比其信号强度代表了双链DNA分子数量。荧光定量PCR基础原理26/39退火：产生荧光信号结合SYBRGreenI荧光定量PCR基础原理27/39SYBRGreenI染料仅在与双链DNA（dsDNA）结合时发射荧光，所发射光波是蓝色光。SYBRGreenI不会与单链DNA结合，所以变性时荧光强度最低。dsDNA形成单链（图A）合成双链（图B）时，SYBRGreenI结合于dsDNA上，结合SYBRGreenI（绿色光）荧光信号强度增强。延伸末期（图C）时，全部DNA均是双链，结合状态SYBRGreenI含量达最大，该PCR周期中荧光信号也达最大。所以，通常是在延伸期结束时进行SYBRGreenI荧光信号测定。荧光定量PCR基础原理28/39染料法优缺点优点缺点成本低只能检测单一模板，无法多重检测通用性好无模板特异性，非特异性扩张和引物二聚体也产生荧光适合初步筛查敏感度低，不能准确测序低拷贝模板融解曲线功效，分析非特异性扩增荧光本底高，易引发假阳性荧光定量PCR基础原理29/39荧光定量PCR基础原理30/39荧光共振能量转移（FRET）当某个荧光基团发射谱与另一个荧光基团吸收光谱重合，且两个基团距离足够近时，能量能够从短波长（高能量）荧光基团传递到长波长（低能量）荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)，实际相当于短波长荧光基团释放荧光被屏蔽。Hybprobe探针和水解探针均基于FRET（荧光共振能量传递）原理设计。荧光定量PCR基础原理31/39TaqMan探针法-水解探针PCR扩增时在加入一对引物同时加入一个特异性荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。TaqMan探针为一寡核苷酸，包含两个分子标识，探针5′端标识有荧光汇报基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端标识有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，如TAMRA等。荧光定量PCR基础原理32/39探针完整时，汇报基团发射荧光信号被近距离淬灭基团吸收；伴随PCR进行，Taq酶在链延伸过程中碰到与模板结合探针，其5‘－3’外切酶活性将探针酶切降解，使汇报荧光基团和淬灭荧光基团分离，游离于反应体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。荧光定量PCR基础原理33/39荧光定量PCR基础原理34/39TaqMan探针数量关系每扩增一条DNA链，就切断一条探针；每切断一条探针，就产生一个单位荧光信号，实现了荧光信号累积与PCR产物形成完全同时；信号强度与结合探针DNA分子数成正比，汇报信号强度就代表了模板DNA拷贝数。所以该技术可对模板进行准确定量。因为扩增产物较短时效率较高，故扩增加度普通为50—150bp。荧光定量PCR基础原理35/39TaqMan探针优点特异性高多重基因定量荧光强度正比于产物不可逆反应信号生成后不会自动淬灭荧光定量PCR基础原理36/39RealtimePCR优点对整个PCR实时监控，明确了指数扩增期，进而可对起始模板进行定量，且定量范围广；测定敏感性高，比电泳方法灵敏度高2-3个数量级；测定准确度和重复性好，Ct值和模板起始浓度有函数关系；大大降低试验室“污染”可能性