叶绿体的分离与荧光观察

关于叶绿体的分离与荧光观察第1页，共73页，2023年，2月20日，星期三目的要求基本原理实验用品方法与步骤实验结果实验报告第2页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验目的1．通过植物细胞叶绿体的分离了解细胞器分离的一般原理和方法2．了解荧光显微镜的使用原理和方法3．观察叶绿体的自发荧光和次生荧光第3页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗的介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。在一给定的离心场中同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间就能使非均一悬浮液中的颗粒按照大小、密度先后沉降在离心管底部。第4页，共73页，2023年，2月20日，星期三荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时能在短时间内放射出比照射波长更长的光（如可见光），称为荧光。有些生物体内物质受激发光照射后可直接发出荧光，称自发荧光，如叶绿素的火红色第5页，共73页，2023年，2月20日，星期三材料本身不发荧光，但吸收荧光染料后同样也能发荧光，称次生荧光，如叶绿体吸收吖啶橙后发的橘红色荧光。第6页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验方法1．选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称40克于150ml0.35mol/lNaCL中，装入组织捣碎机低速匀浆5min，将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。然后用手动匀降器手动匀浆2到3min。2．取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃取沉淀第7页，共73页，2023年，2月20日，星期三3．将上清液在3000r/min下离心5min，弃上清，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）4．将沉淀用0.35mol/lNaCL溶液悬浮第8页，共73页，2023年，2月20日，星期三5．取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后可在光学显微镜和荧光显微镜下观察①在普通光镜下观察②在荧光显微镜下观察③滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，荧光显微镜下观察第9页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验结果普通光镜下可看到叶绿体为绿色橄榄形，高倍镜下可看到叶绿体内部有较深的小颗粒，就是基粒。荧光显微镜下叶绿体发火红色荧光，加吖啶橙后发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。第10页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验报告

1、观察叶绿体的形态结构,测量5~10个叶绿体的长轴和短轴求其平均值。2、记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，分析结果。第11页，共73页，2023年，2月20日，星期三细胞的凝集反应第12页，共73页，2023年，2月20日，星期三目的要求基本原理实验用品方法与步骤实验结果实验报告第13页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验目的理解凝集素使细胞发生凝集反应的原理，观察细胞的凝集现象。第14页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验原理细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为：细胞之间的联系，细胞的生长的分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。第15页，共73页，2023年，2月20日，星期三

凝集素（lectin）是一类含糖的（少数除外）并能与糖专一结合的蛋白质，它能具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用，凝集素使细胞凝集是由于他与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。第16页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验用品1、材料：土豆块茎2、器材和仪器：显微镜，粗天平，载玻片，滴管2支，离心管2支。3、PBS缓冲液称取NaCl7.2g，Na2HPO41.48g，KH2PO40.43g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH为7.2第17页，共73页，2023年，2月20日，星期三4、2%的红细胞以无菌方法抽取甲鱼血（加抗凝剂），用生理盐水洗5次，每次离心2000rpm，5min；之后按红细胞压积（红细胞在血液中所占的容积比值称为红细胞压积）用生理盐水稀释为2%的红细胞悬液。第18页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验方法1、土豆凝集素的制备称取去皮土豆块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡2h，浸出的粗提液中即含有可溶性土豆凝集素。凝集反应第19页，共73页，2023年，2月20日，星期三用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞悬液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min后于低倍镜下观察血球凝集现象。以PBS液加2%红细胞悬液作对照实验。第20页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验结果相较于对照，加上凝集素后，许多鸡红细胞凝集在一起结成球状。第21页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验报告简图表示红细胞凝集原理。第22页，共73页，2023年，2月20日，星期三细胞膜的渗透性第23页，共73页，2023年，2月20日，星期三目的要求基本原理实验用品方法与步骤实验结果实验报告第24页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验目的1了解细胞膜的渗透性

2了解各物质进入红细胞的速度第25页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验原理

当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透人的溶质分子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞内溶质浓度增加时，导致水的摄人。第26页，共73页，2023年，2月20日，星期三红细胞膨胀到一定程度时，细胞膜破裂，即红细胞发生溶血.由于溶质透人速度不同，溶血时间也不同。第27页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验用品

试剂：0.17mol／L氯化钠，0.17mol／L氯化铵，0.17mol／L硝酸钠，0.12mol／L硫酸钠，0.12mol／L草酸钠，0.12mol／L醋酸钠，0.32mol／L葡萄糖，0.32mol／L甘油，0.32mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇。仪器：显微镜，载玻片，盖玻片，吸管，小烧杯，试管，试管架第28页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验方法

1、低渗溶液：取试管1支，加入10mL蒸馏水，然后再加入1mL稀释的鸡血，注意观察溶液的颜色变化，溶液由不透明的红色变为红色透明，红细胞发生破裂，造成所有红细胞溶血，使光线容易通过。显微镜下观察溶血前后红细胞的形态。

第29页，共73页，2023年，2月20日，星期三2、鸡血红细胞的渗透性：取试管10支，分别加入上述10种溶液各10mL，再加入1mL稀释的鸡血，记下时间，轻轻摇动使混匀，注意是否发生溶血；若发生溶血，记录溶血过程所需的时间（自加入稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。第30页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验结果不同的试剂导致细胞的不同反应。1，溶血，注意时间不同；2，不出现溶血，为什么？第31页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验报告第32页，共73页，2023年，2月20日，星期三细胞融合第33页，共73页，2023年，2月20日，星期三目的要求基本原理实验用品方法与步骤实验结果实验报告第34页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验目的1.了解PEG诱导细胞融合的原理2.掌握细胞融合技术第35页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验原理聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可，用作细胞融合剂。聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的第36页，共73页，2023年，2月20日，星期三表面张力作用，从而使细胞发生融合，进而细胞质沟通，形成一个双核或多核细胞第37页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验用品1.器材：离心机，移液枪，水涡锅，载玻片，盖玻片，血细胞计数板，刻度试管，刻度吸管，电炉，冷冻离心管，显微镜，烧杯，吸管2.试剂：Alsever溶液，GKN溶液，0.85%生理盐水，50%PEG，蒸馏水第38页，共73页，2023年，2月20日，星期三0.85％生理盐水：0.85g氯化钠溶于100mL重蒸水中。ALsver液：葡萄糖2.05g,枸橼酸钠0.8g,NaCl0.42加蒸馏水至100mlGKN液：NaCl8g，KCl0.4g,Na2HPO4·2H2O1.77g，NaH2PO4·H2O0.69g,葡萄糖2g,苯酚红0.01g溶于1000ml蒸馏水中第39页，共73页，2023年，2月20日，星期三50％PEG混合液：称取少许PEG(Mw6000)放人刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其溶化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃的等体积的GKN液，混匀。注意使用前配制。第40页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验方法1.取新鲜的鸡血与Alsever溶液以1：4的比例混匀，可在冰箱内存放一周（4℃）2.取1ml贮存鸡血加入4ml0.85%生理盐水，充分混匀800r/min,3min弃上清，重复离心两次。3.弃上清再加4mlGKN溶液离心，加GKN液，制成细胞悬液。第41页，共73页，2023年，2月20日，星期三4.取上述细胞悬液1ml与刻度试管中，用血细胞计数板计数，用GKN液将其调整为5×106个/ml5.取上述细胞悬液1ml于另一刻度试管中，放入37℃水浴中，浴热20min，PEG液也浴热20min第42页，共73页，2023年，2月20日，星期三6、20min后，将0.5ml50%PEG液逐滴沿管壁加入到1ml细胞悬液中，边加入边摇匀，然后再放入37℃水浴中保温20min。7、20min后，取少量于载玻片上，置显微镜下观察。第43页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验结果显微观察，应发现一些多核和双核的较大的细胞。表明细胞发生了融合。第44页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验报告第45页，共73页，2023年，2月20日，星期三线粒体的分离与观察第46页，共73页，2023年，2月20日，星期三目的要求基本原理实验用品方法与步骤实验结果实验报告第47页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验目的1、了解差速离心法分离线粒体的方法2、学习体外活染的方法第48页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验原理差速离心：在一定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间就能够使这些颗粒按其大小、重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。第49页，共73页，2023年，2月20日，星期三悬浮介质：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能够保持细胞器的结构和酶的活性。詹纳斯活染：詹纳斯绿B是对线粒体专一的、毒性很小的、活性染料，由于其碱性，解离后第50页，共73页，2023年，2月20日，星期三带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。第51页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验用品绿豆芽、烧杯、匀浆机、纱布、剪刀、1%詹纳斯绿B、0.25M蔗糖+0.01MTris-Hcl缓冲液、低/高速离心机、显微镜、玻片、滤纸第52页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验方法1、选取鲜嫩的绿豆芽用剪刀剪取芽体约30克加入200ml0.25M蔗糖tris-Hcl缓冲溶液，装入组织捣碎机匀浆，将捣碎液用6层纱布过滤于烧杯中。2、取滤液5ml于离心管中，1500r/min离心10min。第53页，共73页，2023年，2月20日，星期三3、取上清1ml于EP管中，13300r/min离心10min，弃上清。4、将沉淀用1ml缓冲液悬浮，然后13300r/min离心10min，弃上清，沉淀即为线粒体。第54页，共73页，2023年，2月20日，星期三5、取沉淀涂片，不待干即滴加詹纳斯绿B染20min，盖上盖玻片，镜检。6、注意整个操作过程应注意使样品保持4摄氏度左右，避免酶失活。涂片时勿太浓密第55页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验结果线粒体呈小棒状或哑铃状，活的线粒体呈蓝绿色，失活的线粒体透明。第56页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验报告第57页，共73页，2023年，2月20日，星期三脂质体的制备

第58页，共73页，2023年，2月20日，星期三目的要求基本原理实验用品方法与步骤实验结果实验报告第59页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验目的学习制备脂质体的方法。第60页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验原理脂质体常用类脂如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、胆固醇等制备。其中最常用的是磷脂酰胆碱和胆固醇的混合物。利用磷脂的双亲分子特性，加入水相后形成囊状或液晶态，用超声波处理，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分子或分子团，并自动重新排布成类似生物膜的双分子层囊泡。第61页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验用品器材超声波清洗机、光学显微镜、旋涡混合器、离心机、试管、Ep管、移液枪试剂磷脂液：100mg经丙酮-乙醚法纯化的卵磷脂，57.2mg胆固醇，溶于1mL氯仿。第62页，共73页，2023年，2月20日，星期三Tris缓冲液：称取Tris0.12g,EDTA0.288mg,溶于80mL去离子水中，用0.1mol/L盐酸调pH7.2，再加水至100mL。1%番红花红染液。第63页，共73页，2023年，2月20日，星期三实验方法1．配制磷脂液、Tris缓冲液。2．取660µL磷脂液于一小试管中，加入番红花红染液500µL,再加入1060µLTris缓冲液。3．将混合液旋涡混合1min,然后于超声波清洗机中处理10min,取出静置30min,可见液体分为三层。第64页，共73页，2023年，2月20日，星期三4．取中层液体20µL于Ep管中，再加入550µLTris缓冲液，5000rpm离心3min,取下层观察。第65页，共73