四肢动物肢体的发育

关于四肢动物肢体的发育第1页，共50页，2023年，2月20日，星期三脊椎动物肢体发生曾是胚胎学研究的经典问题，从一定意义上讲，它与整个胚胎的发育有许多可以类比的地方，例如，鸟翅的发生既有各部分组织结构分化构建的问题，也存在前后、背腹、左右对称的问题。此外，在进化上肢体也是多样化发生十分突出的问题。第2页，共50页，2023年，2月20日，星期三人上肢的结构第3页，共50页，2023年，2月20日，星期三反应停导致的海豹畸形第4页，共50页，2023年，2月20日，星期三畸形青蛙第5页，共50页，2023年，2月20日，星期三多氯联苯导致的前肢畸形第6页，共50页，2023年，2月20日，星期三鸡翅骨骼模式图尺骨桡骨肱骨腕骨示三个发育轴：近侧-远侧轴、前后轴及背腹轴。第7页，共50页，2023年，2月20日，星期三在所有的四足动物中，附肢发育的基本形态发生原则（basicmorphogeneticrules）是相同的。构建一个附肢所需要的位置信息要在一个三维（或包括时间在内的四维）的、相互协调的系统中发挥作用。现在已鉴定了一系列蛋白，在附肢近远轴、前后轴和背腹轴的形成过程中发挥作用。第8页，共50页，2023年，2月20日，星期三一、肢芽的形成脊椎动物的附肢在起源上是由胚胎体壁向外生长形成的，主要是由来自中胚层的疏松间质形成的中央核，以及来自外胚层的表皮两大部分组成。附肢的原基称为附肢芽（limbbud）。附肢芽形成的位置在每一物种是恒定的，由Hox基因沿身体前后轴表达的水平决定。第9页，共50页，2023年，2月20日，星期三鸡胚胎的肢芽。孵化后第三天胚胎的侧面出现肢芽第10页，共50页，2023年，2月20日，星期三许多脊椎动物胚胎中的预定附肢区（prospectivelimbarea）已被定位。能形成一个附肢的所有细胞，称为附肢场（limbfield），包括位于中央的、产生附肢本身的中胚层细胞（附肢盘，limbdisc）以及形成周围的躯干组织和肩带的细胞。附肢场起初具有调节失去或增加部分附肢的能力，附肢场中的每个细胞都能被指令形成附肢的任意一部分。第11页，共50页，2023年，2月20日，星期三肢体盘（limbdisc）：肢体场(limbfield):由有能力形成一个肢体的中胚层细胞所组成的区域。肢体场细胞的特点：可调节性。中央区将形成自由活动的附肢，包围中央区的灰色和浅色半环形细胞带分别是肩带和围臂组织。这些区域以外的外周组织（深色环形）通常不直接参与肢体的发育，但是如果切除中央组织，它们有可能诱导肢体形成。第12页，共50页，2023年，2月20日，星期三二、附肢的早期发育

附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用附肢发育起始于肢场侧板中胚层（四肢骨的前体）和体节中胚层（四肢肌肉的前体）间质细胞的增殖。体节中胚层细胞沿胚胎长轴的增殖，逐渐在表皮的下面形成厚的间质细胞团，可能与两对附肢形成的位置有关。第13页，共50页，2023年，2月20日，星期三两栖类胚胎侧板中胚层的细胞增值引起肢芽外突，这些细胞将产生肢体的骨骼，迁移到肢芽的体节细胞产生肌肉。生肌节细胞（紫色）进入肢芽的计算机三维重构模式图。侧板中胚层肢体骨骼前体肢芽肢体肌肉前体内胚层

原肾

脊索第14页，共50页，2023年，2月20日，星期三两栖类胚胎中附肢由中胚层起源的图解第15页，共50页，2023年，2月20日，星期三覆盖在间质细胞团表面的表皮变得稍微增厚，同时被包裹在内部的间质细胞团向外突出，形成肢芽（limbbud）。肢芽形成的信号是由形成预定附肢间质细胞的侧板中胚层细胞提供的，这些细胞分泌的FGF10能够启动上皮和中胚层细胞之间的相互作用。含有FGF10的磁珠（bead）异位放置于上皮下方，会诱导出额外的肢芽。第16页，共50页，2023年，2月20日，星期三FGF10的表达及其在鸡肢发育过程中的作用第17页，共50页，2023年，2月20日，星期三三、顶外胚层嵴的形成随着鸟类和哺乳类的中胚层间质细胞进入肢区，它们分泌的因子诱导肢芽顶端前、后边缘的外胚层细胞伸长，形成一个增厚的特殊结构，称为顶外胚层嵴（apicalectodermridge，AER）。AER是一个临时的结构，对于附肢的继续向外生长是至关重要的。第18页，共50页，2023年，2月20日，星期三FGF10能够诱导鸡胚背腹交界处的外胚层形成AER。在背部化的肢芽突变体中，由于没有背腹交界，便不能形成AER。第19页，共50页，2023年，2月20日，星期三AER的作用：

1.维持其内侧的间质细胞的增生能力，使肢体沿Proximal－Distal轴线生长。

2.持续产生和分泌P-D轴分化决定因子。

3.与控制A－P和D－V轴线的因子互作，以指导细胞的分化。第20页，共50页，2023年，2月20日，星期三AER的形成依赖于背部外胚层和腹部外胚层的互作A.移植手术：将一个肢芽的腹部外胚层细胞移植到另一肢芽的背部外胚层中；B.手术26h后将产生一个额外的AER（三角所指）；C.在顶端外胚层嵴形成过程中，肢芽中表达的radicalfringer基因限制在背腹连接处背侧细胞中表达，这部分细胞将发育为AER第21页，共50页，2023年，2月20日，星期三

附肢的向外生长涉及AER和中胚层间持续的相互作用。一旦中胚层诱导其上方的外胚层形成AER，AER与中胚层的相互作用对附肢的向外生长是最重要的。中胚层在附肢发育中也起着关键的作用。AER起初的形成和继续存在依赖于位于其下方的中胚层。附肢发育中至少要求三种类型的外胚层和中胚层间的相互作用：第一，中胚层起始附肢芽向外生长和形成AER；第二，AER进一步刺激肢芽的向外生长以及肢芽中胚层的增殖和分化；第三，附肢芽中胚层提供保持AER所必须的刺激。第22页，共50页，2023年，2月20日，星期三肢芽起始形成的分子模型侧板中胚层分泌的FGF10诱导背腹边缘外胚层表达FGF8，外胚层分泌的FGF8又反过来诱导间质细胞增殖和肢芽后段表达sonichedgehog基因。Sonichedgehog

基因诱导肢芽后段外胚层表达FGF4，由此构成了一个持续性的区域化多基因诱导网络，导致肢芽的形成。AER区外胚层也表达FGF2，其是否被FGF10诱导还不清楚。第23页，共50页，2023年，2月20日，星期三肢芽形成的分子模型第24页，共50页，2023年，2月20日，星期三四、肢体近-远端发育的实现肢体近-远端发育的实现是AER和肢芽间质细胞相互作用的结果。肢芽的逐渐向外生长是由于位于AER下面间质细胞的增殖，而AER释放的分子维持间质细胞不断进行分裂。由AER合成、释放到其下的间质中的成纤维细胞生长因子FGF可能是鸡胚中维持间质细胞增殖的分子。第25页，共50页，2023年，2月20日，星期三AER在肢芽沿P－D轴生长中的作用AER的主要责任是诱导间质组织不断的生长和促使其骨骼的形成，而肢芽间质组织则决定着肢体发育的类型。第26页，共50页，2023年，2月20日，星期三AER中FGF8的表达是肢体生长所必需的A.原位杂交显示肢芽开始形成时Fgf8在外胚层中的表达；B.Fgf8在AER的表达;C.FGF8在正常的3天鸡胚前后肢芽的AER中表达，此外，也在包括咽弓在内的其他部位表达。第27页，共50页，2023年，2月20日，星期三AER对P－D轴线影响的分子基础是FGF因子A.将第20期的鸡胚胎翅芽AER移去后，只形成肱骨；B.将一个吸吮了盐溶液的缓释胶珠植入发生带，也只形成肱骨；C.将一个吸吮了FGF2的缓释胶珠植入发生带，肢芽继续生长，形成尺骨和桡骨；D.如果在第一个缓释胶珠失效时，植入第二个吸吮了FGF2的缓释胶珠，则肢芽继续生长，形成掌骨和指骨。第28页，共50页，2023年，2月20日，星期三发生带Progresszone是指AER内保持了旺盛分裂能力的间质细胞区域。不同时间离开progresszone的细胞分化为不同的软骨。证据之一是，在不同时间去除AER，所形成的肢体骨不同。先离开的间质细胞分化为发育为肢体的近端部分，后离开的间质细胞发育为远端部分。第29页，共50页，2023年，2月20日，星期三发生带（PZ）细胞控制近-远端分化A.将早期翅芽的PZ移植到已经形成尺骨和桡骨的晚期翅芽中，形成额外的尺骨和桡骨；B.将晚期翅芽的PZ移植到早期翅芽中，中间结构缺失。第30页，共50页，2023年，2月20日，星期三PZ区作用模式第31页，共50页，2023年，2月20日，星期三间质细胞离开PZ区的时间决定了其分化命运第32页，共50页，2023年，2月20日，星期三删除平行同源Hox基因会导致发育中肢骨丢失A.野生型小鼠前肢；B.Hoxa-11和Hoxd11基因双突变小鼠的前肢缺失尺骨和桡骨；C.HOXD-13位点纯合突变导致并指；D.Hox基因控制前肢不同部位分化的假说：Hox9~13分别对应肩胛骨、肱骨、尺骨与桡骨、掌骨、指骨。第33页，共50页，2023年，2月20日，星期三人的多指症也可能与Hox基因的异位表达有关第34页，共50页，2023年，2月20日，星期三五、肢体A－P轴线的确定

鸡肢芽尚未形成之前，其A－P和D－V轴线就已经确定。(移植的肢芽的极性不受受体胚胎极性的影响)第35页，共50页，2023年，2月20日，星期三将额外的ZPA移植到肢芽的前端可导致远端形成镜像对称结构肢体前后方向的决定来自早期就存在于肢芽后侧的称为极性活化区（zoneofpolarizingactivity,ZPA）的小块间质组织的作用。第36页，共50页，2023年，2月20日，星期三SonicHedgehog的表达部位与ZPA吻合原位杂交显示，在脊椎动物的肢芽中sonichedgehog基因表达并仅表达在ZPA区域。第37页，共50页，2023年，2月20日，星期三SonichedgehogwasfoundtobeexpressedintheZPA第38页，共50页，2023年，2月20日，星期三极性活化区位于后部间质细胞区附肢发育中的位置信号图中以不同的色块表示sonichedgehog基因的不同表达强度，而色块中的数字表示，如果将这些区域被切下并移植到早期肢芽前部边缘，造成额外肢体发生的百分数。第39页，共50页，2023年，2月20日，星期三

将sonichedgehog

基因插入一种鸡病毒强启动子后端，用此重组病毒转染体外培养的鸡胚胎成纤维母细胞。感染细胞离心分离后植入具有抗此病毒感染能力的鸡胚胎的肢芽前侧，此病毒不能感染受体胚胎，但移植的感染细胞具有表达并分泌高水平sonichedgehog基因的能力。结果显示接受移植的胚胎长出了镜像对称肢体，这说明sonichedgehog基因有造成发育极化现象的功能。Sonichedgehog基因的极性活化实验第40页，共50页，2023年，2月20日，星期三ZPA活性决定A－P轴线的信号传导机制A.短距信号顺序替换推进模型，即一种信号（如2）生成细胞诱导前方细胞产生同样的信号，自身变为另一种信号生成细胞（如3），并依此类推下去；

B.短距信号级联诱导模式，即原初信号生成细胞诱导邻近细胞成为新的另一种信号生成细胞（如4），这个细胞又诱导前方相邻的细胞分化为再一种信号的生成细胞（如3），并依此类推下去；

C.信号浓度梯度模型，即原初信号发生细胞不断产生同样的信号物质，但是由于在它周围形成了信号物质的浓度梯度分布，并由此诱导相邻远近不同的细胞产生不同的分化（如4、3、2）。第41页，共50页，2023年，2月20日，星期三六、肢体D－V轴线的确定在背部外胚层特异性表达的Wnt-7a诱导背部间质细胞合成转录因子Lmx-1，后者再控制肢芽背部特异性基因的表达。若Lmx-1在背、腹间质细胞中都表达，导致双背部结构。

Engrailed在小鼠肢芽腹部外胚层表达，其突变体的肢芽腹部外胚层可表达Wnt-7a，从而形成双背部结构。第42页，共50页，2023年，2月20日，星期三Wnt7a缺陷型小鼠肢体背-腹分化的改变A.野生型小鼠15.5d胚胎前爪的组织切片，可以观察到腹面腹腱和腹足垫的结构（箭头）；B.Wnt7a缺陷型小鼠15.5d胚胎前爪的组织切片，背面也有了腱和足垫的结构。图中：dt-背腱；dp-背足垫；vt-腹腱；vp-腹足垫第43页，共50页，2023年，2月20日，星期三七、前后肢的区分鸡翅和腿的前软骨细胞体外培养时对不同形态分化因子的应答不同，鸡翅和腿前软骨细胞对血清、TGF-β、视黄酸、纤粘连蛋白的应答效果。左边3组照片是光镜照片，右边1组照片是荧光显微照片。第44页，共50页，2023年，2月20日，星期三Tbx5和Tbx4分别指定了前肢芽和后肢芽的发育在鸡正常发育中，原位杂交显示Tbx5在侧板中胚层前端表达，而Tbx4在后端表达，含Tbx5的肢芽形成翅，含Tbx4的肢芽形成腿；人的Holt-OramSyndrome表现为心脏和手的畸形，而脚是正常的，其TBX5基因发生了突变第45页，共50页，