实时荧光定量原理及应用

实时荧光定量原理及应用第一页，共四十六页，2022年，8月28日主要内容荧光定量PCR原理荧光定量PCR方法与应用第二页，共四十六页，2022年，8月28日荧光定量PCR定义

在PCR反应体系中，加入荧光集团，利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，最终对初始模板进行定量。第三页，共四十六页，2022年，8月28日传统PCR定量与实时定量PCR

传统的PCR定量是一种终点法的检测：

动态范围受限检测重现性极差

实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测：

灵敏度高重复性好动态范围宽高通量第四页，共四十六页，2022年，8月28日Gel-basedquantification11,500counts/5200counts=2.2folddifference第五页，共四十六页，2022年，8月28日Real-timequantificationCt18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifference第六页，共四十六页，2022年，8月28日Ct终点检测重复性好精确度高误差小传统PCR与实时定量PCR第七页，共四十六页，2022年，8月28日阈值threshold：在荧光信号指数扩增阶段，在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值，一般我们将荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。CT=cyclethreshold即阈值循环数：荧光信号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。阈值与CT值第八页，共四十六页，2022年，8月28日检测极限[DNA]CycleCtCtCt阈值thresholdC(t)值与阈值第九页，共四十六页，2022年，8月28日荧光定量PCR原理

起始模板浓度的对数与C(t)值成反比第十页，共四十六页，2022年，8月28日如何定量绘制标准曲线所测样本C(t)值定量第十一页，共四十六页，2022年，8月28日标准曲线通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品的Ct值，依据Log起始拷贝量与Ct的线性关系，就可以计算出样品中所含的模板量第十二页，共四十六页，2022年，8月28日荧光定量PCR方法荧光染料法荧光探针法第十三页，共四十六页，2022年，8月28日SYBRGreenI™

TaqMan®MolecularBeaconsDNAbindingProbebaseddetectionTaqTaq染料和探针第十四页，共四十六页，2022年，8月28日SYBRGreen:最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm

染料只与双链DNA小沟结合，单链不结合游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度增强1000倍

不能区分引物二聚体，单链二级结构，非特异性产物需要做熔解曲线分析产物的单一性SYBRgreen是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势，在试验验证和问题分析上非常有用。SYBRGreen法作用机理第十五页，共四十六页，2022年，8月28日熔解曲线分析单一峰，无非特异性产物，定量准确有杂峰，有非特异性产物，定量不准确第十六页，共四十六页，2022年，8月28日unboundprobe

freeinsolutionLightemissionLightenergytransferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLightemissionLight特点：

特异性高：只有引物和探针都和同一模板结合时才能检测完全实时监测：一分子荧光信号对应一条DNA链的产生多通道检测：可以在一次反应中同时检测多个不同目的基因序列Taqman探针法Taqman探针：是与目的序列互补的寡聚核苷酸，5‘端标记荧光报告集团，3’端标记荧光淬灭集团，探针完整时不发出荧光，水解后发出荧光。第十七页，共四十六页，2022年，8月28日HCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHIV-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpampliconTaqman三通道实验DanielCandotti-Cambridge,UK第十八页，共四十六页，2022年，8月28日绝对定量相对定量SNP分析实时定量PCR应用第十九页，共四十六页，2022年，8月28日应用之一：病原体检测与定量绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数－病原体的多少）标准品（如质粒）：做系列梯度稀释待测样本阴性对照（NTC）第二十页，共四十六页，2022年，8月28日应用之一：病原体检测与定量1432第二十一页，共四十六页，2022年，8月28日应用之一：病原体检测与定量第二十二页，共四十六页，2022年，8月28日应用之二：基因表达差异分析相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的倍数两种样品：Calibrator（对照，如正常组织）与Sample（待测样品）两个基因：目的基因与看家基因第二十三页，共四十六页，2022年，8月28日Normalizer看家基因应用之二：基因表达差异分析CalibratorSampleGeneofInterest目的基因CtCtCtCtCt1Ct2第二十四页，共四十六页，2022年，8月28日应用之二：基因表达差异分析基因表达差异＝2

/2Ct1Ct2＝2Ct1-Ct2第二十五页，共四十六页，2022年，8月28日应用之二：基因表达差异分析RNA抽提RT定量PCRcDNA产物系列稀释两个基因的扩增效率第二十六页，共四十六页，2022年，8月28日应用之二：基因表达差异分析1234第二十七页，共四十六页，2022年，8月28日

应用之二：基因表达差异分析第二十八页，共四十六页，2022年，8月28日两条探针分别针对不同等位基因ACGTACGT应用之三：SNP分析第二十九页，共四十六页，2022年，8月28日应用之三：SNP分析FAMTETFAMTET12第三十页，共四十六页，2022年，8月28日应用之三：SNP分析21第三十一页，共四十六页，2022年，8月28日Thankyou！选择吉泰，选择成功！第三十二页，共四十六页，2022年，8月28日试验设计与优化PCR是精确性很高的实验，实验前我们需要完整的实验设计方案，而且实验条件对结果影响也很大。PCR扩增效率：保证实验的精确性和重复性。影响扩增效率的因素：扩增子长度；扩增子GC含量；扩增子、引物、探针二级结构；PCR各组分反应浓度；模板浓度。第三十三页，共四十六页，2022年，8月28日引物设计原则扩增片段100-200bp引物长度18-30bp，Tm在58-62℃之间，上下游引物Tm值不超过2℃GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基，3’端不为G或C。避免引物内二级结构，引物间二聚体出现。跨外显子设计引物，消除基因组DNA扩增第三十四页，共四十六页，2022年，8月28日探针设计原则Taqman探针长度25-32bp，Tm在68-72℃之间，确保比引物的Tm值大5-10℃GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基5’端不能为G，G能淬灭荧光信号Taqman探针要靠近上游引物，最好只有一个碱基距离。避免探针与引物间形成二级结构SNP位点应设计在探针中间位置第三十五页，共四十六页，2022年，8月28日实时PCR体系优化基本参数的优化MgCl2的浓度，DNA：2-5mM;mRNA：4-8mM。模板浓度，系列稀释梯度模板，CP在15-30之间。而CP值的确定经验上是SYBRGreen荧光信号是本底的2倍，杂交探针荧光强度是本底的0.3倍。第三十六页，共四十六页，2022年，8月28日使用SYBRGreen测定DNA的优化MgCl2的浓度，2-4mM模板浓度，DNA：50ng-5pg；质粒：106拷贝引物浓度，0.3uM退火浓度，比计算出的Tm小5℃第三十七页，共四十六页，2022年，8月28日使用SYBRGreen进行一步法RT-PCR的条件优化MgCl2的浓度，4-8mM模板浓度，总RNA或mRNA：1pg-1ug第三十八页，共四十六页，2022年，8月28日杂交探针测定DNAMgCl2的浓度，不要超过2mM探针浓度，0.2uM第三十九页，共四十六页，2022年，8月28日杂交探针进行实施定量RT-PCRMgCl2的浓度，4-8mM之间探针浓度，0.2uM模板浓度设置，1pg-1ug的总RNA或是mRNA第四十页，共四十六页，2022年，8月28日荧光定量PCR仪的硬件条件激发光源热循环－加热、制冷样品检测设备第四十一页，共四十六页，2022年，8月28日荧光定量PCR仪应满足的要求光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料能分开不同荧光素的激发光与发射光波长能检测的灵敏度与动态检测范围准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.第四十二页，共四十六页，2022年，8月28日

Stratagene公司成立于1984年,致力于发展生命科学领域的创新产品与科技.总部位于美国LaJolla,California.在欧洲与日本设有分公司.2007年被Agilent公司收购，成为Agilent公司旗下品牌。Stratagene公司简介第四十三页，共四十六页，2022年，8月28日Mx3000P整体设计热盖热循环系统石英卤钨灯发射光滤镜轮激发光滤镜轮光纤扫描臂第四十四页，共四十六页，2022年，8月28日仪器优势石英