实验二原核生物基因组的制备

实验二原核生物基因组的制备第一页，共十七页，2022年，8月28日一、实验目的掌握从细菌中提取基因组DNA的基本原理熟悉利用试剂盒提取细菌DNA的技术流程提取卡介苗BCG基因组DNA第二页，共十七页，2022年，8月28日二、实验原理①裂解细胞②除去蛋白质③析出DNA第三页，共十七页，2022年，8月28日CTAB(cetyltriethylammoniumbromide，十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液(0.7mol/lNaCl)中可溶并且稳定存在。此时的高盐溶液中除含有CTAB-核酸复合物外，还含有大量的多糖和蛋白。第四页，共十七页，2022年，8月28日核酸提纯(1)用氯仿先对此高盐溶液进行抽提，大量蛋白和多糖等被从溶液中抽提沉淀出来，而核酸仍留在溶液中；接着可用乙醇或异丙醇将核酸从溶液中沉淀出来，然后用水或TE缓冲液等将核酸溶解。第五页，共十七页，2022年，8月28日(2)降低溶液中盐的浓度(0.3mol/lNaCl)，CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中；通过离心将CTAB-核酸沉淀下来，然后溶解于高盐溶液中。第六页，共十七页，2022年，8月28日三、实验材料卡介苗BCG细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）DP302水浴锅、离心机、移液器第七页，共十七页，2022年，8月28日试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为特有新型材料，可高效、专一吸附DNA，最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建等实验。第八页，共十七页，2022年，8月28日四、注意事项实验中所有的废弃物均要高压灭菌。第九页，共十七页，2022年，8月28日五、实验步骤（1）取细菌培养液1-5ml，10,000rpm，1min，尽量吸净上清。（2）沉淀中加入180μl溶菌酶溶液（20mg/ml），37℃，60min。（3）加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。（4）加入220μl缓冲液GB，振荡15s，70℃，10min，溶液变澄清。瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。第十页，共十七页，2022年，8月28日（5）加入220μl无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。（6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。第十一页，共十七页，2022年，8月28日（7）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（8）向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。第十二页，共十七页，2022年，8月28日（9）重复步骤⑧。（10）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm，2min，弃废液。将吸附柱CB3室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。第十三页，共十七页，2022年，8月28日（11）吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm，2min，将溶液收集到离心管中。（为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm，2min）第十四页，共十七页，2022年，8月28日五、结果检测紫外吸收法检测所提取基因组DNA的浓度与纯度；取少量DNA溶液在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离并在核酸紫外检测仪上观察。第十五页，共十七页，2022年，8月28日少量DNA溶液在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离图片第十六页，共十七页，2022年，8月28日六.思考题（1）操作第（4）步骤的时候溶液是否变得清亮？如