医学微生物学 HIV-z

医学微生物学–病毒人类免疫缺陷病毒感染及其相关疾病1.1人类免疫缺陷病毒HIV属于反转录病毒科(Retroviridae)慢病毒毒属(Lentivirus)的成员。HIV分为1型的2型两种，HIV-1全球流行，HIV-2则只在非洲流行。HIV感染可导致人类获得性免疫系统缺陷综合征（艾滋病，AIDS）。HumanImmunodeficiencyVirus,HIV1.2人类免疫缺陷病毒的发现---发现者之争1981年6月美国CDC首次报道了5例（LosAngeles）不明原因卡氏肺孢虫肺炎病例，患者都是同性恋者，此前只知道这些疾病仅见于免疫缺陷或抑制病人，如器官移植、液血肿瘤等。这个报告立即得到全美许多医生的响应，他们在近两年来陆续也在许多年青患者中看到大量难以解释的疾病，如原虫CNS感染、淋巴腺病、恶性肿瘤（如卡波氏肉瘤），这些病例后被称为获得性免疫缺陷综合症（Aquired

ImmunodeficiencySyndrome,AIDS）1983年法国巴斯德研究所LucMontagnier从法国淋巴结病病人血液中分离到HIV-1型1984年美国NIHRobertGallo称也分离到HIV，并研制出抗-HIV诊断试剂盒。法方认为美国分离的HIV是法国提供的标本，因此，提出成果分享的法律诉讼，经过长期的论证，1994年美方承认法国Montagnier为HIV发现者，从而结束了近10年的论战。2008年LucMontagnier和FrancoiseBarre-Sinoussi因HIV的发现获得诺贝尔生理及医学奖。1.2人类免疫缺陷病毒的发现---里程碑1959年，刚果（民）境内的一名班图族成年男子是迄今所能确认的世界最早的AIDS患者（由冻存血液样本检测证实）。1980年，有正式资料记载的首例AIDS“零号病人”，法裔加拿大籍的飞行员GaetanDugas，死于1984年。在最早死于AIDS的19人中，有8位跟此人有直接或间接性关系；另一项针对最早的248名AIDS患者的调查显示，Dugas与其中的至少40人有性关系。1985年，我国首次发现AIDS，是一例到中国旅游的美籍阿根廷青年，发病5天后死于北京。1989年，中国本土发现第一例因性接触而感染的AIDS患者。2012年，全球存活的HIV感染者超过3400万人，截止2012年10月底，中国累计报告艾滋病病毒感染者和病人492191例，存活者为383285例。性传播为主要传播途径。1.2人类免疫缺陷病毒的发现---分子起源Nature455,661-664(2October2008)据推测，HIV最早可能出现于1900-1910年间Nature397,436-441(4February1999)HIV-1与HIV-2两者都来自非洲中西部，并从灵长类动物（如黑猩猩）传到人类。1.3全球HIV感染的流行状况<0.1%Nodata0.1%-0.5%0.5%-<1%1%-<5%>15%-28%5%-<15%GlobalPrevalenceofHIVinAdults=0.8%14-59岁人群HIV感染率约为0.8%，2011年新发感染250万人，艾滋病相关死亡170万人。撒哈拉以南地区仍然是艾滋病疫情最为严重的地区，大约每20名成人中有1名感染HIV(4.9%)，其次为加勒比海、东欧和中亚地区。2.1HIV的病毒学特征---电镜下的HIV2.2HIV的病毒学特征---HIV的病毒结构gp120/gp41膜蛋白病毒脂膜整合酶逆转录酶病毒核壳病毒RNA2.3HIV的病毒学特征---HIV的基因组结构主要基因：gag,pol,env,vif,vpr,vpu,rev,tat,nef2.3HIV的病毒学特征---HIV的生活史1,病毒与细胞受体结合2,病毒与细胞融合后病毒蛋白进入细胞3,在病毒逆转录酶作用下形成病毒DNA4,病毒DNA转运如细胞核并在整合酶作用下整合至宿主基因组5,整合的病毒DNA转录出新的病毒RNA，这些RNA一方面翻译出新的病毒蛋白，另一方面也作用新病毒的基因组RNA6,病毒RNA和病毒蛋白转运至细胞3.1HIV的致病机制原发感染急性期潜伏期AIDS相关综合征系统性AIDS3.2HIV感染的疾病分期3.3HIV感染的临床表现感染分期临床表征诊断表征原发性HIV感染急性期类流感样症状，主要症状为疲乏、持续发热、夜间出汗、肌痛、关节痛、眼眶后痛、淋巴腺病、脾肿大、水样泻、全身性红斑和口腔念球菌病等。常出现在感染后2-12周内。HIVP24抗原阳性;HIV抗体阳转;HIV

RNA阳性;淋巴细胞比例轻度降低;无症状HIV感染期无明显临床表征。出现在急性期后，可持续2-10年，部分甚至长达15年以上。HIV抗体阳性;HIVRNA阳性;CD4细胞计数正常或轻度降低AIDS相关综合征（ARC）持续全身性淋巴结肿大(PGL)，体重迅速减轻，可伴随发热、疲劳、食欲不振、呼吸困难.

出现多种机会性感染，如:

CMV/

HSV/

VZV等病毒感染症；结核病发作；深部真菌感染症；原虫、寄生虫侵染等。HIV抗体阳性;HIVRNA阳性;CD4细胞计数显著降低;免疫功能显著低下系统性AIDS（晚期）各种严重机会性感染及并发症，可发生Kaposis肉瘤，非何杰金淋巴瘤等恶性肿瘤；中枢神经系统障碍，痴呆和消耗综合征等。HIV抗体阳性;HIVRNA阳性;CD4细胞计数很低;免疫功能全面崩溃3.4HIV感染可能导致的各种并发症PCP(卡氏肺囊虫肺炎,寄生虫感染)鹅口疮(真菌感染)卡波氏肉瘤(KS)视网膜炎性损伤,失明3.5.1HIV的传播途径---血液传播经血液传播：共用针头静脉吸毒、接受被污染的血制品、纹身、纹眉、共用剔须刀等3.5.2HIV的传播途径经过性传播：同性恋无保护性交、不洁性交等3.5.3HIV的传播途径---母婴垂直传播母婴垂直传播3.5.4HIV的传播途径---各种传播方式的统计概率感染途径估计感染机率输血>90%分娩25%共用注射器静脉吸毒0.67%经皮针扎0.30%肛交—受方0.50%肛交—攻方0.065%性交—女方0.10%性交—男方0.05%口交—受方0.01%口交—攻方0.005%估计通过各种途径（单次行为），感染HIV的风险上述数据均假设在无任何保护措施及事后预防性治疗措施的前提下。2023/2/16握手咳嗽或打喷嚏昆虫叮咬一般的身体接触、拥抱或礼节性接吻饮水或食物，共用茶具、餐具共用卫生设施、游泳池工作场所或学校的接触共用电话…3.5.5日常生活事件不会导致HIV传播4.1HIV感染的诊断病毒抗原：p24抗原机体产生的特异性抗体：p24抗体、gp120各区段抗体、gp41抗体等病毒核酸检测：实时荧光定量PCR病毒培养：对样品进行细胞培养，检测培养上清的p24抗原以判断原样品是否含有HIVCD4细胞计数：流式细胞术4.2HIV快速检测—现场初筛血液（也可以是尿液、唾液等组织液）筛查胶体金试剂检测HIV抗体阳性阴性4.3HIV实验室免疫学检测—酶联免疫吸附试验1、第三代HIV抗体检测试剂（只检测血液中HIV抗体）2、第四代HIV抗体检测试剂（同时检测血液中存在的P24抗原和HIV抗体）4.4HIV实验室免疫学检测—RIBA或WB确认试验HIV抗体确证检测：蛋白质印迹（RIBA、western

blot等）如果可检测到血清样品中含有针对HIV两种以上单抗的抗体，即可确认为抗HIV阳性4.5HIV实验室细胞学检测—CD4细胞计数通过流式细胞术测定血液中CD4阳性的淋巴细胞数量，反应HIV感染者免疫功能被破坏的程度CD4细胞计数：500-1600个/uL，正常；350-499个/uL轻度抑制；

200-350

个/uL轻度抑制；<200个/uL重度抑制。4.6HIV实验室病毒学检测—HIV

RNA定量HIV实时荧光逆转录PCR方法检测HIV

RNA载量窗口期分为第一窗口期和第二窗口期前者是指从病毒感染到能够用目前的诊断试剂检测出来的一段时间；后者是指感染后发生Ag-Ab血清转换过程中，p24抗原滴度降低到不能检出而HIV-Ab还未升高到能被检出的一段时间，一般仅数天，甚至不出现。窗口期的长短与所采用诊断试剂的灵敏度有关4.7HIV检测的窗口期感染时间点窗口期:平均约5-6周(2-12周)第四代试剂抗原抗体联检第三代试剂单检抗体4.7HIV检测的窗口期Transmissioncanoccurduringpregnancy,labor&delivery,andpostpartumduringbreastfeedingNotallinfantsborntowomenlivingwithHIVwillacquireHIVinfection在无任何干预措施的条件下，HIV阳性的母亲所生子代感染HIV的估计风险为25%-40%。5.1HIV感染的预防---母婴传播预防5.1HIV感染的预防---母婴传播预防叠氮胸苷（AZT，商品名为齐多夫定），第一个抗HIV药物，1994年开始应用于HIV母亲的母婴传播预防，效果显著。5.1HIV感染的预防---母婴传播预防WHO指南母亲治疗：齐多夫定/替诺福韦+拉米夫定/恩曲他滨+奈韦拉平/依非韦伦5.2HIV感染的预防---高危险事件/人群预防性投药替诺福韦+恩曲他滨可降低MSM中HIV感染替诺福韦凝胶可降低性行为中女性HIV感染5.3HIV感染的预防---疫苗CD4CD4CD4HIVCCR5(CXCR4)CCR5(CXCR4)chemokineMutantCCR5CD4+Tcell5.3HIV感染的预防---HIV疫苗研制的难点HIV的外膜蛋白（gp120

+gp41）的高变性HIV外膜蛋白的免疫优势表位并不是中和表位HIV外膜蛋白的中和表位免疫原性很弱，无法激起接种者有效的中和抗体应答5.3HIV感染的预防---HIV疫苗突破口4E102F5PGT128PG9VRC01BurtonetalScience337:183,2012找到HIV外膜蛋白的保守中和表位，正确模拟并移植到免疫增强载体，使之免疫人群后能有效刺激产生广谱中和抗体5.3HIV感染的预防---HIV疫苗突破口HIV疫苗：三十年失败后的一点点曙光，RV144试验mITTPPmonthEventsEfficacyEventsEfficacy61654%n/an/a124260%2168%186744%4141%248236%5327%309536%6231%3.5yearsafterfirstvaccination:ProtectiveEfficacy=31.2%P=0.04 95%CI:1.1–52.1%NoeffectonviralloadX6.1HIV感染的治疗---治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)非核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)蛋白酶抑制剂(PIs)融合抑制剂(ELS)整合酶抑制剂(II)现有抗HIV药物可分为五大类6.2HIV感染的治疗---核苷类逆转录酶抑制剂NRTIs是天然核苷的类似物，通过与内源性的dNTP竞争性结合逆转录酶的活性中心而发挥抑制作用，NRTIs进入细胞膜后，在细胞酶(胸苷激酶、胸苷酸激酶)的磷酸化作用下转化成相应的三磷酸酯，结构类似内源性dNTP，而HIV的逆转录酶缺乏3'-5'校正的功能，很容易发生错配，三磷酸酯化的NRTIs被逆转录酶错误引入延长的DNA链中，由于其缺乏3'-羟基，导致DNA链不能继续延长，HIV不能逆转录为cDNA，从而阻断逆转录病毒的生命周期6.2HIV感染的治疗---第一个NRTIs:齐多夫定Zidovudine(AZT,齐多夫定,叠氮胸苷)---第一个抗HIV药最初作为抗癌药研发,后来发现具有很好的抗HIV作用,于1987年被FDA批准应用于HIV感染治疗.AZT是一种核苷类逆转录酶抑制剂,

在体内被磷酸化后,可有效阻断HIV新生核酸合成主要副作用包括贫血和骨髓抑制6.2HIV感染的治疗---核苷类逆转录酶抑制剂Tenofovir(替诺福韦)Abacavir(阿巴卡韦)Zidovudine(齐多夫定)Stavudine(司他夫定)Lamivudine(拉米夫定)Emtricitabine(恩曲他滨)Apricitabine(艾立西他滨)Zalcitabine(扎西他滨)……6.3HIV感染的治疗---非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTIs是一类在结构上差异很大，但作用机制相似的化合物。不同于NRTIs，它们的结构与内源性dNTP相去甚远，其作用机制是通过与反转录酶的非底物结合部位上的1个变构亲脂部位结合引起逆转录酶构象改变而抑制病毒的反转录酶活性。NNRTIs具有相当高的选择性，选择指数（selectivityindex，SI）可达上万甚至十万，对细胞的毒性很小，而且在极低的浓度时也能抑制HIV－1的复制.Efavirenz—依非韦仑Nevirapine—奈韦拉平Delavirdine—地拉韦定Etravirine

—依曲韦仑……NNRTIs只有HIV-1有效，而对HIV-2无效，想比于NRTIs，NNRTIs副作用显著降低Tyr-181Tyr-188Leu-100Val-106Val-179NevirapineEfavirenz6.3HIV感染的治疗---非核苷类逆转录酶抑制剂6.4HIV感染的治疗---蛋白酶抑制剂病毒核酸分子较小，为了高效利用其序列，通常病毒基因组先表达出大的前体蛋白，然后经蛋白酶切割，裂解为多个病毒结构和功能蛋白。在HIV中，由HIV蛋白酶行驶此项功能。HIV蛋白酶是一个小分子的同二聚体蛋白，属于天冬氨酸蛋白酶，主要在HIV病毒复制周期中的后期发挥作用，即将gag和gag-pol基因产物裂解成病毒成熟所需要的结构蛋白(基质、壳、核壳)和酶类(蛋白酶、整合酶、逆转录酶)，体内抑制此酶的活性，其子代病毒仍会产生，但不能成熟而不具有传染性的，从而阻止病毒的进一步感染扩散。6.4HIV感染的治疗---蛋白酶抑制剂Fosamprenavir--福沙那韦Atazanavir--安扎那韦Darunavir--达如那韦Lopinavir--洛匹那韦Saquinavir--沙奎那韦Ritonavir--利托那韦……S3S1S2S2’S1’Saquinavir—沙奎那韦6.5HIV感染的治疗---融合抑制剂ELS可以是蛋白、多肽、抗体，也可以是有机小分子，主要通过阻断HIV与细胞膜的识别与融合抑制HIV的感染过程，可有效阻止HIV传播，降低病毒载量。6.5HIV感染的治疗---融合抑制剂Roche公司开发的enfuvirtide（恩夫韦地）Enfuvirtide（T20）是与GP41上一段36AA的肽，能与竞争性抑制HIV与细胞膜融合Enfuvirtide是一种与传统抗HIV药物作用机理完全不同的抑制剂已被FDA批准与其他药物联用Enfuvirtide—恩夫韦地Pfizer开发的一种新型CCR5受体抑制剂Maraviroc通过抑制CCR5与GP120的结合而阻断病毒进入细胞2007年被FDA批准Maraviroc—麦瑞韦若克6.5HIV感染的治疗---整合酶抑制剂整合酶是HIV病毒DNA进入宿主基因中进行特殊的DNA重组反应的关键酶。宿主细胞内的病毒基因组通过逆转录形成cDNA，然后转运入宿主基因组内并通过整合酶将其整合入宿主基因组上，形成前病毒进行复制。因此通过抑制整合酶的活性可以阻断病毒DNA整合进入宿主细胞染色体，达到抑制病毒复制的目的。现有1种药物：雷特格韦（raltegravir）于2007年10月获FDA批准进入临床用于出现多重耐药的患者。6.6HIV感染的治疗---”鸡尾酒”疗法1996年，由美籍华人科学家何大一博士提出，学名为HighlyActiveAntiretroviralTherapy(HAART,高效抗逆转录病毒治疗)。HAART的中心原则是给予多种药物联合治疗，尽可能完全、持久地抑制病毒复制，同时最大限度地避免产生药物毒性。联合交替使用2种HIV逆转酶抑制剂和一种蛋白抑制剂，将血液中HIV含量降到最低，极大延长感染者寿命。ViralSpike–TargetofBroadNeutralizingAntibodiesBurtonetal.,Science329:770-773(2010)Walkeretal.,PLoSPathogens6:1-14(2010)Tomarasetal.,J.Virol.85(21):11502(2011)Neutralizingantibodiesintheseraof19HIV-1infectedindividualsareassociatedwithoneormoreoftheseepitopesontheviralspikeFourmajorepitopesV1/V2&V3CD4bsgp120gp41MPERPG9,PG16,PGTsb12,HJ16&VRC01-likenAbs2F5,4E10,Z13&10E8Antigen-SpecificB-CellSortingProcedure

Expressionofmonoclonalantibodiesandcharacterization

ofneutralizationbreathDeterminationandanalysisofantibodystructuresincomplexwithHIV-1gp120Peripheralbloodmononuclearcells(PBMCs)FlowcytometrysortingWuetal.(2010)Science

329,856.VRC01VRC03VRC-PG04YuxingLiandRichardWyattABroadlyNeutralizingAntibody–VRC01Zhouetal.(2010)Science

329,811Heavygp210LightVRC01VRC01focusespreciselyontheCD4-bindingsite(greensurface),thepreviouslydefinedsiteofvulnerability.CD4-gp120VRC01-gp120gp210Donor74VRC-PG04/gp120(2.1Å)gp120LightHeavyVRC01-/VRC03-/VRC-PG04-gp120ComplexesTongqingZhougp120HeavyLightVRC01/gp120(2.6Å)Donor45VRC03/gp120(1.9Å)gp120LightHeavyAntibodiesthattargetCD4-bindingsiteandsharethesameepitoperecognitionasVRC01,VRC03andVRC-PG04arereferredtoas

“VRC01-likeantibodies”D368R71D368R71D368R71FromAntibodiestoAntibodyomeBycombiningdeepsequencingandbioinformaticsanalysis,andwiththestructureandsequenceinformationofknown

VRC01-likeantibodies,wecanidentifythewholefamilyofVRC01-likeantibodiesandunderstandtheirmaturationprocess.Hypothesis:454GermlinegeneSharedepitopeVRC01VRC02VRC03VRC-PG04VRCX?……SequencespaceStructuralspacegp120WhyAntibodyomeAnalysisIsComplicatedV(D)JrecombinationV1V2V3VnD1J1J2JnGenesinheavychainlocusD2Dn229alleles34alleles13allelesCAffinitymaturationbysomatichypermuation&clonalselectionCV1V2V3VnD1JnRemovalofunwantedDandJgenesegmentsandD-JsegmentrecombinationD2CJunctionV1JnRemovalofunwantedVandDgenesegmentsandVDJrecombinationD2CJunction>100,000possibilitiesAffinitymaturationUpto100changesinVgenealonePipelineOutput–GermlineFamilyDistributionDistributionofgermlinegenesfordonor45IGHV1-2*02:VRC01germlineAUsefulParameter:GermlineDivergenceDistributionofIGHV1-2*02divergencefordonor74VRC01=32.1%VRC03=29.4%VRC-PG04=28.7%AnotherUsefulParameter:SequenceIdentityDistributionofsequenceidentitytoVRC-PG04Divergence-identityContour/Grid–HeavyChainDistributionofheavy-chainantibodyomein2DspaceVRC01VRC02VRC03VRC-PG04/VRC-PG04bVRC03VRC01VRC02VRC-PG04/VRC-PG04bDonor45>100VRC03-likenAbs!Donor74VRC-PG04/VRC-PG04bVRC03VRC01VRC02>5000VRC-PG04-likenAbs!Divergence-identityPlot–LightChainDistributionofdonor45light-chainantibodyomein2DspaceDonor45Black/Redtrianglesrepresentsequenceswiththecharacteristic2-residuedeletioninCDRL1Twosequences,#181371and#223454,showhighidentitytoVRC01andVRC03Testing454-DerivedSequencesbyNeutralizationHeavy-chainneutralizationplottedon2Dcontour(223454)VRC01HVRC-PG04HVRC03HIC50<1μg/mlIC501-50μg/mlIC50>50μg/ml(181371)gVRC-L2d45gVRC-L1d45Light-chainneutralizationshownasdendrogram24heavychainsequencescouldpairwithVRC01-likelightchainsandshowedneutralizationinthe6-viruspanel!MaturationIntermediatesfromPhylogeneticAnalysis109sequencesinneutralizingsubtreeI45II45III450.1Criticalnodalpoints–ancestors–inmaturationdonor45MaturedantibodyI45:23VRC03:93II45:41InferredmaturationintermediatesIII45:56Neutralizing!Germlinegp120Asp31Arg61CDRH2I45:23gp120CVJDCTR……WGXGCDRH3EmpiricaldefinitionbyCDR-H3

CDR-H3alignmentClass1143251_3_non----------GTGGGTGGAGCCGCTGATGATAGTGGTTA--TACAGAGCCCCCTTCTGACTACClass2121325_4_nonGCAGGGGTATGGTTCGGGGAGTTATTACCTCATTGGTCAGGCGTCGGTGGGGGTATGGACGTCClass313826_2_neut----------AAGACAGCGGGCGACGTCAGCGGTGACAA--CCGGGGCTACTTCTTCGATCTC164922_3_non----------AAGACAAAGGGCGATGTCAGCGGTGACGA--CCGGGGCTTCTTCTTCGATCTC166726_3_non----------AAGACAAAGGCCGATGTCAGCGGTGACGA--CCGGGGCTTCTTCTTCGATCTC179400_4_neut----------AAGACAGCGGGCGACGTCAGCGGTGACAA--CCGGGGCTACTTCTTCGATCTC167612_4_neut----------AAGACAGCGGGCGACGTCAGCGGTGACAA--GCGGGGCTTCTTCTTCGATCTC179500_4_non----------AAGACAAAGGGCGATGTCAGCGGTGACGA--CCGGGGCTTCTTCTTCGATCTCConsensusAAGACAGCGGGCGACGTCAGCGGTGACGA--CCGGGGCTACTTCTTCGATCTCClass495589_2_neut----------AGAAAAGAG---------------GACGA--CTACGACTGGTATTACGATCTCClass524972_2_neut-------AAGAAAAGGGGG---------------GACGG--CTTCAATTTGTATTTCGATCTCClass610731_1_neut-------CAGACTTTCAAGCCTGATTTCTACTTTGCGGA--CCAGGGCTGGAGTTTCAATCTCClass7149768_4_non-------CAGAAATTTGCG---AGG---------GGCGA--CCAAGGCTGGTTCTTCGATCTC120119_4_non-------CAGAAATTTGCG---AGG---------GGCGA--CCAAGGCTGGTTCTTCGATCTC186275_2_neut-------CAGAAATTTGCG---AGG---------GGCGA--CCAAGGCTGGTTCTTCGATCTC86984_2_neut-------CAGAAATTTGCG---AGG---------GGCGA--CCAAGGCTGGTTCTTCGATCTC196147_4_neut-------CAGAAATACTAT---GCG---------GGCGG--CCAAGGCTGGTATTTCGATCTC195462_4_non-------CAGAAGTTCTAT---AAG---------GGCGG--CCAAGGCTGGTACTTCGATCTC43567_2_non-------CAGAAATTTTAT---GCG---------GGCGG--CCAAGGCTGGTACTTCGATCTC31458_3_non-------CAGAAATTTTAT---GCG---------GGCGG--CCAAGGCTGGTACTTCGATCTC127586_4_non-------CAGAAATTTTAT---GCG---------GGCGG--CCAAGGCTGGTACTTCGATCTC149590_4_neut-------CAGAAATTTTAT---GCG---------GGCGG--CCAAGGCTGGTACTTCGATCTC53821_1_neut-------CAGAAATTTGCG---AGG---------GGCGA--CCAAGGCTGGTTCTTCGATCTC165478_2_neut-------CAGAAAT-TTAT---GTC--------GGGCGG--CCAAGGCTGGTACTTCGATCTC71632_2_neut