第五讲胚胎工程演示文稿

第五讲胚胎工程演示文稿第一页，共三十八页。优选第五讲胚胎工程第二页，共三十八页。超数排卵超数排卵是一种不正常的排卵，经外源激素处理的雌性动物，改变其性周期，使之按照预定时间超常量的排卵。1只KM小鼠取得胚胎83枚，有1只兔取得胚胎88枚，有1只金黄地鼠采得72枚胚胎第三页，共三十八页。超数排卵的生理基础第四页，共三十八页。促卵泡激素(FSH)FSH为糖蛋白激素，由α、β两个亚单位结合，β亚单位是决定生物活性的其生物功能是刺激卵巢中卵泡成熟并分泌雌激素。第五页，共三十八页。促黄体激素(LH)也称促间质细胞激素(ICSH)，为糖蛋白质激素.LH的α和β两个亚单位相互结合在一起时，才具有强的生物活性。LH所特有的生物作用是由β亚单位决定的它的生物功能是激发排卵，促使黄体从萎缩破裂的卵泡中形成并分泌雌激素和孕激素。第六页，共三十八页。孕马血清促性腺激素(PMSG)这是一种比较特殊的促性腺激素，是一种糖蛋白结构PMSG分子，包含α和β亚单位，β亚单位是体现生物活性的功能团。在活体中，PMSG的半存留期，比垂体和其他胎盘促性腺激素要长。PMSG的β亚单位只能和PMSG的α亚单位结合；但是，PMSG的α亚单位可以和FSH的β亚单位、LH的β亚单位及HCG的β亚单位结合，而且使这几种β亚单位都具有生物活性。第七页，共三十八页。人绒毛膜促性腺激素(HCG)是人胎盘分泌的一种糖蛋白激素。HCG分子包含α和β亚单位。受精卵着床的第1天，孕体的滋养层细胞开始分泌HCG，孕后10d左右在尿中和血中都可以查出来。有人把HCG叫做全身激素，胎儿的HCG遗传密码能产生大量HCG，而成年人各组织和多种癌细胞也能产生HCG。但是只有胎盘的HCG是经滋养糖基化的糖蛋白质激素，这样的HCG才具有生物活性。HCG分子中的α和β亚单位一定是结合的形式，β亚单位才能够体现出生物活性，生物活性的强弱是β亚单位上的唾液酸含量决定的。HCG的生理作用是多方面的，这里主要是它促卵泡发育并排卵的作用，增大超数排卵的效果。第八页，共三十八页。超数排卵的影响因素动物遗传特性、体况、营养状态、年龄、发情周期的阶段、卵巢的功能状态、季节、温度激素的品种与用量第九页，共三十八页。胚胎培养

二十世纪30年代Nicholas和Rudnik就开始对啮齿动物胚胎进行体外培养并获得成功。啮齿类动物着床后胚胎培养(WEC)不仅被胚胎学家运用于胚胎正常发育的研究，而且其在环境致畸物的筛检及致畸机理研究中的应用亦愈来愈受到人们的重视。第十页，共三十八页。胚胎保存超低温长期冻存胚胎具有较强的实际意义。它能够使优秀品种品系(包括珍稀和濒危动物)的种质得到长期保存下来，逐步地将生物界的所有生命基因都长期保存起来，防止基因丢失，并且可以随时复苏、繁殖品系动物，在遗传理论指导下，可改良品种和培育新品种及品系，推动生命科学蓬勃发展。胚胎的低温保存不但安全可靠，而且可以减少大量的空间和财力上的支出，因此它是目前实现实验动物资源保存的最为有效的方法。世界上一些发达国家以此方法建立起了各自的包括实验动物在内的胚胎库，目前我国国家啮齿类实验动物种子中心和上海分中心等单位正在开展胚胎和配合子低温保存的研究。第十一页，共三十八页。胚胎保存的方法缓慢降温法玻璃化低温保存法。第十二页，共三十八页。两种方法的比较两种方法最大的不同点在于缓慢冷冻方法可靠安全，但需要特殊的仪器设备(程序降温仪等)，该方法适用于大型实验动物单位和保种单位；而玻璃化低温保存则对设备要求相当低，利于普及，适用于保存一些特殊品系且数量较少的单位。第十三页，共三十八页。胚胎嵌合将动物品系内、种内、种间或属间的两个或多个胚胎以聚合或注入等方法嵌合在一起培养，使之发育成为一个胚胎，称为嵌合胚胎。再将该胚胎移植给受体，发育成个体。如该动物具有两种以上动物胚胎的细胞则称之为嵌合体动物，如同类黑鼠和白鼠胚胎嵌合，生下黑白相间的花小鼠。目前嵌合体动物有小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪和牛等；种间嵌合体动物有大鼠-小鼠嵌合体，绵羊-山羊嵌合体，马-斑马嵌合体，牛-水牛嵌合体等。第十四页，共三十八页。嵌合体技术

动物胚胎嵌合技术即通过显微操作，使2枚或2枚以上受精卵(胚胎)的全部或部分胚胎细胞嵌合在一起，人工复合胚胎，以获得嵌合体动物的技术。主要有聚合法和注射法两种。第十五页，共三十八页。BALB/C-C57胚胎嵌合体小鼠

第十六页，共三十八页。聚合法一般是把8细胞至桑椹胚前期的胚胎去掉透明带后，将两个胚胎的卵裂球聚合在一起，形成一个胚胎，经体外培养发育至囊胚阶段，再移植给受体。对于移植前需要透明带的动物，用8细胞至桑椹胚前期的胚胎制作种间或异种嵌合体时，将供、受体胚胎去透明带后，将卵裂球分裂，各取一半放入一方透明带内，用PHA使之聚合并包埋琼脂，然后移植到该种动物输卵管内使之发育至囊胚再移植，或体外培养发育至囊胚再移植给受体。第十七页，共三十八页。注射法是把细胞注入到囊胚腔内。注射用细胞可以是卵裂球，也可以是发育后期胚胎细胞，甚至可以是畸胎瘤细胞和ES细胞。第十八页，共三十八页。嵌合体技术应用在实验动物应用领域，嵌合体技术主要应用于人类遗传疾病动物模型的研究，如人唐氏综合征、神经管不全、白血病等均通过嵌合体方法建立了动物模型；结合ES细胞和基因导入，再通过嵌合体方法建立遗传病动物模型，以寻求治疗方法。此外，嵌合体可应用于许多领域，如作为发育生物学的研究材第十九页，共三十八页。

胚胎分割

通过对胚胎的显微操作,人工制造同卵双胞胎或多胞胎的技术，胚胎分割是哺乳动物胚胎工程的重要组成部分。其操作有两种方式，一种是在8细胞阶段以前，将每个卵裂球(2-4细胞阶段)或两个卵裂球(4或8细胞阶段)作为一组，分别放入一个空的透明带内，继续发育成一个胚胎；另一种方式是对桑椹胚至囊胚期的胚胎进行分割，然后把每一份放入一个空的透明带内。经过培养再移植，或者将一个具有几个卵裂球的胚胎，用机械或化学的方法使卵裂球分开，对每一个卵裂球进行培养，使其再分裂变成一个可移植的胚胎。第二十页，共三十八页。胚胎分割技术应用可以与其他胚胎生物技术相结合，为胚胎转基因技术、性别鉴定技术提供活胚检查的方法，为胚胎嵌合、胚胎干细胞技术提供卵裂球分离的方法和手段，胚胎分割还可以获得遗传上同质的后代。第二十一页，共三十八页。核移植(nucleartransplantation，NT)就是将动物早期胚胎卵裂球或动物体细胞的细胞核移植到去核的(同种或异种)受精卵或成熟的卵母细胞质中，从而获得重构卵，并使其恢复细胞分裂，继续发育为与供体细胞基因型完全相同的后代的技术。核移植技术最早由德国胚胎学家Spemann于1938年首次提出，是为了研究细胞核的全能性和发育过程中细胞核与细胞质的相互关系而建立的。早期的研究工作主要集中在两栖类和鱼类；哺乳动物的核移植研究始于1969年，但由于其卵母细胞较小而且是体内发育，给研究工作带来一定难度，直到1983年McGrath等建立了一套较为适用的方法并成功地获得了克隆小鼠。第二十二页，共三十八页。核移植技术的程序供体细胞培养；卵母细胞的体外成熟、去核；细胞核移植、融合、激活；重构胚的体外培养和胚胎移植；任何一步不理想,都会影响到克隆胚胎或动物的发育。第二十三页，共三十八页。现代核移植技术已由早期研究细胞分化中遗传物质所起的作用，即研究核质互作问题，扩展到转基因、基因打靶等方面；并成为转基因动物扩繁和濒危动物物种保护的一种有效的技术。核移植是实现哺乳动物无性繁殖的重要手段，能产生遗传特性一致的动物群，是培育超纯系实验动物的新途径和有效方法。胚胎细胞核移植技术要比胚胎分割技术进了一步，它是用显微手术的方法分离未着床的早期胚胎细胞，将其单个细胞导入去除染色体的未受精的成熟的卵母细胞，经过电融合，让该卵母细胞质和导入的胚胎细胞核融合、分裂、发育成胚胎。把该胚胎移植给受体，让其妊娠产仔。目前知道的胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。核移植技术在研究两个原核的作用，核质关系和加速繁殖优良实验动物方面，将起着巨大的作用。第二十四页，共三十八页。体外受精(invitrofertilization,IVF)体外受精技术是指通过人工操作使精子和卵子在体外环境中完成受精过程的技术，主要用于培育试管动物。体外受精技术为遗传播种提供了新的选择，因为与体内受精相比对正常精子的需求很少，从而提高了具有性特征的精子利用率的可能性。第二十五页，共三十八页。胚胎移植胚胎移植是将动物的受精卵或发育数日的胚胎,从某一个体(供体)移植到同种动物的另一个体（受体），使之继续发育的技术，亦称受精卵移植或卵移植。经胚胎移植产生的后代从受体得到营养发育成新个体，但其遗传物质则来自它的真正亲代，即供体动物和与之交配的公畜。

第二十六页，共三十八页。

应用

在实验动物学中的应用胚胎移植技术主要是繁殖生物学。早期研究的重点在于卵母细胞的成熟、受精过程和胚胎的早期发育。后来主要研究胚胎与子宫环境的关系，特别是研究影响胚胎存活的一些因素：如胚胎——子宫同期化，妊娠建立对类固醇的需要、母体衰老、胎儿生长的遗传特性，以及转基因和胚胎冷冻等方面。第二十七页，共三十八页。胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)是一种从早期胚胎内细胞团(innercellmass，ICM)或原始生殖细胞(primordialgermcell，PGC)经体外分化、抑制培养、分离和克隆得到的具有发育全能性的，能在体外培养的一种高度未分化的细胞。自从建立了小鼠胚胎干细胞系以来，科学家先后建立了鱼类、鸟类、哺乳动物以及人类的胚胎干细胞系.在培养细胞与个体发育之间、体细胞与生殖细胞之间架起了桥梁。第二十八页，共三十八页。克隆猴第二十九页，共三十八页。PPL公司克隆猪第三十页，共三十八页。克隆高产奶牛第三十一页，共三十八页。克隆鼠第三十二页，共三十八页。

研究:亚系建立、诱导分化条件、化学诱变、转基因动物、克隆动物、分化过程中重要标志的发现、干细胞map建立应用:细胞治疗与组织工程种子细胞第三十三页，共三十八页。治疗性克隆第三十四页，共三十八页。胚胎干细胞以其多能性及无限制增殖为应用优势,而受其肿瘤性及伦理问题所限制成体干细胞以其安全性为应用优势,而受其分离纯化扩增困难所限制第三十五页，共三十八页。两者的共同困难包括:

如何诱导?诱导到什么程度?移入体内的干细胞