植物细胞代谢产物制备

植物细胞代谢产物制备第一页，共七十一页，2022年，8月28日第9章内容安排：I：植物细胞培养II：植物细胞培养生产次级代谢产物的应用举例分析与讨论第二页，共七十一页，2022年，8月28日本节主要内容：1.植物细胞培养技术本节关键问题：1.植物细胞的特点2.植物细胞培养方式：悬浮培养、固定化培养3.植物细胞培养的生物反应器第三页，共七十一页，2022年，8月28日植物细胞培养得到的常见次级代谢物紫草宁小檗碱（黄连素）花青素，花黄素银杏黄酮银杏内酯白果内酯蒽醌青蒿素超氧化物歧化酶木瓜蛋白酶木瓜凝乳蛋白酶香豆素薄荷醇人参皂甙类胰岛素紫杉醇地高辛利血平奎宁碱长春花碱尼古丁鱼腾酮迷迭香酸紫草细胞黄连细胞玫瑰茄细胞，紫苏细胞银杏细胞银杏细胞银杏细胞巴戟天细胞黄花蒿细胞大蒜细胞番木瓜细胞番木瓜细胞胡桐细胞，薰衣草细胞薄荷细胞人参细胞苦瓜细胞红豆杉细胞毛地黄细胞罗夫木细胞金鸡纳细胞长春花细胞烟草细胞鱼藤细胞鼠尾草细胞，鞘心花细胞色素，消炎消炎、止泻食用色素，抗氧化疏通血管，抗氧化治疗心血管疾病治疗大脑和神经系统疾病抗菌消炎，抗肿瘤抗疟疾，退热药抗氧化、抗辐射、抗衰老消炎，肉质嫩化治疗骨质增生，血型检测抗病毒，香精食用香精调节免疫功能，保健治疗糖尿病抗肿瘤强心药降血压抗疟疾治疗白血病杀虫杀虫消炎，抗氧化第四页，共七十一页，2022年，8月28日长春新碱长春碱长春花细胞培养生产生物碱治疗白血病第五页，共七十一页，2022年，8月28日银杏细胞培养生产黄酮、萜类化合物第六页，共七十一页，2022年，8月28日红豆杉细胞培养生产紫杉醇第七页，共七十一页，2022年，8月28日玫瑰茄等植物细胞培养生产色素洛神花第八页，共七十一页，2022年，8月28日什么是初级和次级代谢产物？初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或死亡，是一种基本代谢类型。次级代谢产物

是指生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同种类的生物所产生的次级代谢产物不相同，它们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。第九页，共七十一页，2022年，8月28日一植物细胞培养的定义植物细胞培养（Plantcellculture）是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。获得的细胞群体可以作为制备有价值代谢产物的原料，也可以作为基础研究的材料。同时植物细胞培养技术也是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术。第十页，共七十一页，2022年，8月28日什么是植物细胞培养?与组织培养的区别?

植物细胞培养(plantcellculture):是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术。

1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议：

组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。

细胞培养：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。第十一页，共七十一页，2022年，8月28日植物组织培养⑴培养对象植物的各种组织、器官⑵培养目的获得所需的植物组织和再生植株；快速繁殖。细胞培养⑴培养对象各种形式的植物细胞⑵培养目的获得所需的细胞和各种所需的产物；进行生物转化；将外源底物转化为所需的产物。与植物组织培养的区别第十二页，共七十一页，2022年，8月28日

二植物细胞特点问题1：与微生物相比，植物细胞有什么特点？细菌，真菌、植物细胞都有细胞壁细菌无成形的细胞核，真菌、植物细胞有成形的细胞核。植物细胞比微生物细胞大。第十三页，共七十一页，2022年，8月28日植物细胞直径一般约为10-200μm，平均直径比微生物细胞大30-100倍。植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2-3周，半连续或连续培养时间一般长达2-3个月。植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难。植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。第十四页，共七十一页，2022年，8月28日三植物细胞培养历史20世纪50年代，泰尔克（Talecke）和尼克尔（Nickell）证实植物细胞可生长在悬浮培养液中。随后，人们发现离体培养的植物细胞具有合成代谢产物的能力。1956年，尼克尔（Nickell）和卢荻（Routin）申请了第一个用植物细胞培养生产化学物质的专利。20世纪80年代后期，紫草宁等细胞培养生产次获得了产业化（紫草宁可以用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药）。第十五页，共七十一页，2022年，8月28日四植物细胞培养技术（一）培养基植物细胞培养的培养基主要由碳源、氮源、无机盐、维生素、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。目前应用广泛的基础培养基有MS、B5、N6等，具体内容参见附录。问题2：植物组织培养的培养基组成有哪些？无机盐：大量元素N\S\P\K\Ca\Mg等、微量元素有机物：糖类、氨基酸、维生素等调节物质：激素与微生物培养基相比：需要大量无机盐；多种维生素和激素；一般采用无机氮源；一般以蔗糖为碳源。第十六页，共七十一页，2022年，8月28日生物酶悬浮分散、离心植物组织植物细胞

（二）植物单细胞分离与初步培养植物细胞培养首先需要从植物样品制备单细胞问题3：植物组织培养、细胞融合时单个植物细胞是如何获得的？1.酶解法选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质（纤维素、果胶、多糖）降解，从而使细胞彼此分开，这种方法称为酶解法。经常采用的生物酶包括：纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等。第十七页，共七十一页，2022年，8月28日（1）酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞。加酶过滤、离心第十八页，共七十一页，2022年，8月28日（2）机械法第一种方法：用刀片刮叶片撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞第十九页，共七十一页，2022年，8月28日第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心第二十页，共七十一页，2022年，8月28日机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离；细胞产量低；细胞易破。细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。第二十一页，共七十一页，2022年，8月28日3.愈伤组织法通过培养植物外植体诱导产生愈伤组织，并使其大量增殖，再通过机械震荡或者酶解的方法使细胞分离从而获得游离的细胞。扩增培养、液体悬浮

植物细胞

诱导脱分化外植体第二十二页，共七十一页，2022年，8月28日建立悬浮细胞培养系第二十三页，共七十一页，2022年，8月28日愈伤组织法第二十四页，共七十一页，2022年，8月28日

2.单细胞培养技术

1）平板培养法

指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。此法是Bergman(贝格曼，1960)首创。平板培养的优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察,选择单细胞株和筛选突变体。第二十五页，共七十一页，2022年，8月28日细胞平板培养概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养。主要技术要点：

单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。

单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml。

植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或封口膜将培养皿封严以防污染，在25℃黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的细胞团。第二十六页，共七十一页，2022年，8月28日平板培养法平板培养法第二十七页，共七十一页，2022年，8月28日看护培养（nursingculture）用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖。这块愈伤组织被称为看护组织。由缪尔（Muir）于1953年创立。具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是：简便、成功率高。缺点是不能在显微镜下直接观察。2）看护培养与饲养层培养法第二十八页，共七十一页，2022年，8月28日饲养层培养（Feederlayerculture）把处理过的（如X射线处理）无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。第二十九页，共七十一页，2022年，8月28日微室培养

概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。第三十页，共七十一页，2022年，8月28日1滴含单细胞培养液周围加石蜡油凹穴载玻片旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片平视图置培养皿中26~28℃恒温培养微室培养要求：

微室内不能有气泡。

微室的厚度最好不要超过20微米，盖玻片的厚度要在左右。

观察时要保持温度和培养时一致。第三十一页，共七十一页，2022年，8月28日

3）液体浅层静置培养法

指将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养。该方法优点：易于补加新鲜培养基，便于镜检。第三十二页，共七十一页，2022年，8月28日（三）继代培养1.固体培养平板培养法是经常采用的一种固体培养方式，将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基（含琼脂Agar）的培养皿内进行培养。类似于微生物细胞的平板培养，具体步骤包括：单细胞悬浮液的制备、计数、调节细胞密度、培养基选择、浇平板、接种培养。采用液体培养基进行细胞培2.液体培养养。第三十三页，共七十一页，2022年，8月28日（四）植物细胞悬浮培养细胞悬浮培养（Cellsuspensionculture）是将细胞接种于液体培养基中并保持良好的分散状态的培养方式。植物细胞悬浮培养主要在摇床和生物反应器中进行，培养方法与微生物类似。优点：1.可以增加细胞与培养液的接触，促进营养的吸收。2.保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果。3.可以达到较高的细胞浓度，容易放大培养。第三十四页，共七十一页，2022年，8月28日振荡培养箱第三十五页，共七十一页，2022年，8月28日悬浮培养的生物反应器一般所说的生物反应器是指细胞培养生物反应器，是为细胞生长提供合适的化学与物理环境并能检测控制细胞生长的装置。一般都有三部分组成：反应罐、控制系统、检测分析系统。问题4.与传统微生物发酵罐相比，植物细胞培养的生物反应器有什么特点？第三十六页，共七十一页，2022年，8月28日植物细胞培养的特殊要求植物细胞培养反应器最初大多采用微生物反应器。由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同，植物细胞较微生物细胞大，对剪切力耐受性差，而且对氧的要求相对微生物要低得多，因此微生物反应器并不完全适合于植物细胞生长与生产。植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，而这些天然产物均为细胞次生代谢物。所以，植物细胞培养反应器的设计，不仅要考虑有利于细胞生长，同时还要考虑有利于产物的积累和分离。总体上讲，适合植物细胞的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。光照的提供：外光源、内光源，透明材料。结构尽量简单。第三十七页，共七十一页，2022年，8月28日第三十八页，共七十一页，2022年，8月28日机械搅拌式生物反应器（Stirredtankrioreactor）一般由罐体、搅拌桨、控温系统、气路、传感器等组成。依靠搅拌器使液体产生轴向流动和径向流动。该生物反应器的优点是搅拌充分，供氧能力和混合效果较好。搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细胞，直接影响细胞的生长和代谢，特别对于次级产物生成影响极大。需要对搅拌罐进行改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少产生的剪切力，同时满足供氧与混合的要求。第三十九页，共七十一页，2022年，8月28日不同叶轮产生剪切力大小顺序为：涡轮状叶轮＞平叶轮＞折叶浆＞螺旋状叶轮第四十页，共七十一页，2022年，8月28日Kaman等采用带有1个双螺旋带状叶轮(helicalribbonimpeller)和3个表面挡板的搅拌罐，证明适于剪切力敏感的高密度细胞培养。离心桨生物反应器采用三叶螺旋桨，同时采用微孔金属丝网作为空气分布器，能提供良好的混合状态，具有比机械搅拌桨底的剪切力。第四十一页，共七十一页，2022年，8月28日气升式生物反应器(Air-liftbioreactor)由气升室、气降室、除气室和底部四部分组成。培养液循环的动力来自于气升室、气降室中因含气量不同而在底部产生的压力差，因而比鼓泡型有更均一的流动形式。根据反应器内部结构与气体分布器的位置不同可分为内环流和外环流两种第四十二页，共七十一页，2022年，8月28日第四十三页，共七十一页，2022年，8月28日鼓泡式生物反应器(Bubblecolumnbioreactor)又称为鼓泡塔式反应器，是最简单的气动式生物反应器。气体分布器一般位于底部中央，气体从底部通过喷嘴或孔盘进入反应器。它不含转动部分，整个系统密闭，易于无菌操作。不同于气升式生物反应器，液体在反应器内部呈无规律的湍流状态。培养过程中没有机械能消耗，适合于培养对剪切力敏感的细胞。然而对高密度及粘度较大的培养物，反应器的混合效率会降低。第四十四页，共七十一页，2022年，8月28日其它类型生物反应器转鼓式生物反应器(Rotatingdrumbioreactor)因为转子的转动带动培养罐转动，促进了气体交换与营养物质的吸收，具有悬浮系统均一、低剪切力、防止细胞粘附在壁上的优点，适合于高密度植物悬浮细胞的培养，已用于长春花、紫草的细胞悬浮培养。第四十五页，共七十一页，2022年，8月28日（五）植物细胞固定化培养问题5：植物细胞固定化培养有什么优点？细胞固定化培养（Cellimmobilizationculture）是指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面进行培养的一门技术。是在20世纪70年代的酶固定化催化技术基础上发展起来的。1979年，布洛德利斯（Brodelius）首次成功利用固定化的毛地黄、长春花细胞制备次级代谢产物。第四十六页，共七十一页，2022年，8月28日1.细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小，维持了细胞的稳定性，适合脆弱的植物细胞的培养，同时也利于采用传统生物反应器大规模培养。2.悬浮细胞培养体系中细胞密度比较高时会因粘度增加引起传质困难。固定化细胞培养系统中细胞密度远高于悬浮培养，但并不会改变培养液流体性质，利于传质。3.大多数植物次级代谢产物合成在生长停止后才大量合成。采用固定化培养可以将细胞生长与产物合成分成两个阶段。与细胞悬浮培养相比，植物细胞固定化培养具有以下优点：第四十七页，共七十一页，2022年，8月28日4.细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累。5.固定化增加了细胞与细胞间的接触，促进了细胞间信息传递，利于代谢产物的合成。6.固定化细胞可以反复使用，可以方便地进行产物的连续性收获，降低了成本。第四十八页，共七十一页，2022年，8月28日1.固定化方法吸附、交联、共价结合、包埋等。（1）吸附固定法通过物理吸附、离子吸附（依靠静电引力固着在带有异电荷的载体上）等方法使细胞固定在载体上。（2）共价结合法细胞表面的基团（如氨基、巯基、咪唑基、酚羟基等）和固相支持物表面的基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。第四十九页，共七十一页，2022年，8月28日A将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞。优点：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械力损伤，是目前采用较多的细胞固定方法。缺点：扩散限制，并非所有细胞都能处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到内部。第五十页，共七十一页，2022年，8月28日（3）包埋法A凝胶包埋w/id_XMTM4MzI3NTI0.html问题5：与前面讲过的哪个内容相似？无菌空气入口装有细胞和褐藻酸钠溶液的玻璃瓶细胞和褐藻酸钠混合液形成胶体颗粒的喷射口 隔滤板装有氯化钙溶液的烧瓶第五十一页，共七十一页，2022年，8月28日微囊化（Microencapsulation）是利用天然的或者合成的高分子材料作为囊壁材料将细胞包裹成微米级的微小球囊，形成的微囊膜是亲水半透膜，培养基的营养成分以及代谢产物可以通过微囊膜进行交换。第五十二页，共七十一页，2022年，8月28日在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和阳离子之间形成离子键。因海藻酸钙不溶于水，从而在细胞表面形成凝胶。如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等螯合剂处理将Ca2+离子除去，又能使胶体溶解释放出细胞。当海藻酸钙微囊用多聚赖氨酸处理后，使凝胶微球表面成膜，不会再被螯合剂溶解。再用柠檬酸去除钙离子，球内海藻酸钠成液态，细胞悬浮在微囊内。海藻酸盐(Alginate)—多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)微囊化第五十三页，共七十一页，2022年，8月28日琼脂糖(Agarose)凝胶包埋将细胞悬浮于经过灭菌处理的琼脂糖中，不断搅拌，待混合物凝结后，将包埋有细胞的琼脂糖凝块挤进无菌的金属网中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。这种方法虽然简单，但因制得的颗粒较大、形状不规则。第五十四页，共七十一页，2022年，8月28日2.固定化细胞的活力测定染色法例如：荧光素二乙酸酯（Fluoresceindiacetate,FDA）染料能被活细胞吸收，酶解脱去乙酰基而使这种染料产生荧光。死亡的细胞没有这种现象，因此可以判定固定化后的细胞是否具有活性。呼吸强度测定采用氧电极法测定细胞的呼吸作用来表示细胞的存活率。细胞生长和分解速率的测定细胞数量或重量的增加可以作为细胞活性的指标。由于植物细胞的聚集性特点，采用湿重或干重法比较方便实用。第五十五页，共七十一页，2022年，8月28日3.固定化细胞培养的生物反应器对于固定化的植物细胞可以：（1）采用合适的机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、鼓泡式生物反应器等进行培养。（2）也可将细胞直接吸附或包埋在特殊设计的生物反应器内的介质表面或内部进行培养。第五十六页，共七十一页，2022年，8月28日流化床生物反应器(Fluid-bedbioreactor)通过通入液体或气体使固定化细胞悬浮于反应器中。传质效率高，但是碰撞会破坏固定化细胞。第五十七页，共七十一页，2022年，8月28日填充床生物反应器(Pipe-conebio-filterreactor)细胞固定在支持物的内部或表面，细胞固定不动，流体按照一定方向从反应器中流过实现混合和传质。可以是垂直的，也可以是水平的。一种垂直的填充床生物反应器示意图如图。优点是单位体积细胞的容量大。缺点是混合效率低、易造成传质困难、固定床颗粒或支持物碎片会阻塞液体的流动。

空气出口培养液出口 培养液 固定有细胞 的筛网 包埋有细胞 的颗粒 培养液入口 空气入口第五十八页，共七十一页，2022年，8月28日涓流床生物反应器(Tricklebedbioreactor)又称滴流床反应器，细胞固定在反应器内部，气体从下往上流动，而液体从上往下流动，由于流量小，只能在固定化细胞表面形成涓涓细流。与填充床生物反应器不同，固定化细胞并不被流体浸没，空隙被大量气流占据，因此适合好氧细胞生长。第五十九页，共七十一页，2022年，8月28日（六）植物细胞培养工艺(P57)细胞培养的操作方式：根据细胞培养时营养成分添加方式以及培养液与细胞的收集方式的不同，可以有：分批式、流加式、半连续式、连续式和灌注式五种操作方式。第六十页，共七十一页，2022年，8月28日1.分批式培养（Batchculture）是指细胞和培养基一次性加入到培养容器或生物反应器内进行培养，在培养过程中培养液体积不变，不添加营养成分，待细胞增长和产物积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物和培养液的培养方法。问题6：分批培养过程中，细胞的生长一般分为那几个阶段？五个阶段：延迟期（1）、对数生长期（2）、减速期（3）、平台期（4）和衰退期（5）。第六十一页，共七十一页，2022年，8月28日（1）延迟（适应）期（Lagphase）是细胞适应新环境的阶段。此时细胞很少分裂，营养物几乎不消耗。延迟（适应）期时间的长短与种龄、接种量大小及营养物质新旧环境差异大小有关。采用有活力的种子、适当提高接种量有利于缩短延迟（适应）期。（2）对数生长期(Exponentialgrowthphase)该阶段，由于培养基中的营养物质比较充分，细胞生长不受限制，生长旺盛，细胞浓度随时间呈指数增长。细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比：dX dt=μX式中：X-细胞浓度；t-时间；μ-比生长速率。

式中：X-细胞浓度；t-时间；μ-比生长速率。第六十二页，共七十一页，2022年，8月28日2.303lg⎜⎜⎟⎟在对数生长期，比生长速率达到最大比生长速率μm并保持不变。将细胞浓度变化的对数值与时间作图得到一直线，斜率就是μm。式中：X1、X2-时间为t1、t2时间的细胞浓度；μm-最大比生长速率。细胞浓度增长一倍的时间称为倍增时间(d)。微生物细胞的倍增时间(d)较短：细菌一般为0.25-2h；哺乳动物细胞一般为15-200h，植物细胞倍增时间跨度大，草本类一般为1-3d，木本一般为2-10d。0.693

μmln2

μm=τd=

⎛X2⎞ ⎝X1⎠t2−t1μm=第六十三页，共七十一页，2022年，8月28日典型的分批培养过程特点：体积不变；营养逐渐消耗殆尽；细胞浓度增加后维持不变，逐渐死亡第六十四页，共七十一页，2022年，8月28日（3）减缓期(Progressivedecelerationalphase)由于细胞浓度增高、营养物质消耗、有害代谢产物积累，细胞生长受到抑制，生长速率逐渐下降，细胞生长进入减速期。（4）平台期(Plateauphase)由于细胞浓度增高、营养物质大量消耗、有害代谢产物大量积累，细胞生长受到严重抑制，生长速率下降。生成的和死亡的细胞数量大致相当，细胞生长进入静止期，细胞浓度达到最大值。（5）衰退期(Senescencephase)由于营养耗尽，有害物质大量积累，细胞开始自溶、死亡。大多数分批培养都在进入衰亡期