植物细胞组织

植物细胞组织第一页，共六十一页，2022年，8月28日

第一节植物细胞（组织）培养反应器第二页，共六十一页，2022年，8月28日植物细胞（组织）培养反应器通常广义的植物细胞培养技术包括植物器官、组织、细胞以及原生质体培养，并以此发展起来的各种植物细胞培养技术。植物细胞（组织）培养反应器的研制是植物细胞培养技术向工业化规模发展的关键。第三页，共六十一页，2022年，8月28日一、植物细胞培养过程的特点1．细胞培养液的性质植物细胞要比微生物大得多。在细胞培养过程中，其细胞形态有明显的变化。植物细胞培养液的粘度和微生物发酵液表现出明显不同，它随细胞浓度的增加而显著上升。培养液为非牛顿型流体，属拟塑性流体。

第四页，共六十一页，2022年，8月28日2．植物细胞培养中的传递状态氧传递的研究对于产物的有效生产和较好的经济效益是息息相关的。植物培养细胞的需氧量要比微生物深层培养低得多。第五页，共六十一页，2022年，8月28日起始kLα和最终细胞浓度的关系（培养144h）

第六页，共六十一页，2022年，8月28日二、植物细胞培养反应器

植物细胞培养主要采用悬浮培养和固定化细胞培养系统。悬浮培养所用生物反应器主要有机械搅拌反应器和非机械搅拌反应器。固定化细胞培养反应器有填充床反应器、流化床反应器和膜反应器等类型。第七页，共六十一页，2022年，8月28日1．悬浮培养生物反应器（l）机械搅拌式反应器机械搅拌式反应器能获得较高的kLα值（＞100h－1），而植物细胞培养所需的kLα值一般为5～20h－1

。一般认为机械搅拌式反应器应用于植物细胞培养存在的主要问题是植物细胞的细胞壁对剪切的耐受力差。从以往的研究来看，对搅拌器加以改进，可以减小搅拌过程中的剪切力，从而使搅拌式反应器能更广泛地应用于植物细胞培养上。第八页，共六十一页，2022年，8月28日20m3植物细胞培养装置流程图

第九页，共六十一页，2022年，8月28日（2）非机械搅拌式反应器

通常为气体搅拌式反应器，是一种利用通入的空气作通气和搅拌的生物反应器，主要有鼓泡式反应器和气升式反应器，而气升式反应器又可分为外循环和内循环两种形式。第十页，共六十一页，2022年，8月28日气体搅拌式反应器

（a）鼓泡式反应器（b）内循环气升式反应器（c）外循环气升式反应器第十一页，共六十一页，2022年，8月28日

气体搅拌式反应器（尤其是气升式反应器）十分适于植物细胞生长与次级代谢产物的生成。气体搅拌式反应器必须依靠大量通气输入动量和能量，以保证反应器内培养液的良好传质、传热，并保证不出现死角。但过量的通气同时也易于驱除培养液中的二氧化碳和乙烯，对细胞生长反而有阻碍作用，因而有时也需要降低气体成分的传质系数。同时由于植物细胞的摄氧速率较低，过高的溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利。气体搅拌式反应器第十二页，共六十一页，2022年，8月28日

新疆紫草细胞培养流程（ALCROF反应器）

第十三页，共六十一页，2022年，8月28日2．固定化细胞生物反应器

植物细胞培养的最大问题是培养中的细胞遗传和生理的高度不稳定性。固定化细胞培养可以在一定程度上克服这种倾向。固定化细胞系统也比悬浮培养更适合于植物细胞的培养。固定化细胞包埋于支持物内，可以消除或极大地减弱流质流动引起的切变力。便于连续操作。第十四页，共六十一页，2022年，8月28日固定化细胞培养反应器的类型（1）填充床反应器（2）流化床反应器（3）膜反应器第十五页，共六十一页，2022年，8月28日

填充床反应器示意图

流化床反应器示意图

第十六页，共六十一页，2022年，8月28日几种流化床反应器流程

用藻酸纤维固定化植物细胞的循环流化床反应器

第十七页，共六十一页，2022年，8月28日

实验用流化床生化反应器

第十八页，共六十一页，2022年，8月28日

锥形流化床反应器

第十九页，共六十一页，2022年，8月28日磁场流化床生化反应器

第二十页，共六十一页，2022年，8月28日固定化细胞膜反应器示意图

第二十一页，共六十一页，2022年，8月28日

（a）中空纤维

(b)螺旋卷绕反应器第二十二页，共六十一页，2022年，8月28日三、植物组织培养及反应器利用高度分化的植物器官、组织培养以提高目的产物含量的研究也日益引起人们的重视。在组织培养研究当中，大规模培养系统发展较为迅速的领域主要有以下几种。

1．发状根大规模培养

2.小植物的大规模快速繁殖第二十三页，共六十一页，2022年，8月28日

流化床反应器培养黄花蒿发状根的流程示意图1.反应器2.空气出口3.空气入口4.空气过滤器5.流量计6.空气贮罐7.蠕动泵8.无菌水入口9.无菌水贮槽10.荧光灯第二十四页，共六十一页，2022年，8月28日

浅层循环式植株快速繁殖器l.温度传感器2.出口管3.反应器体4.托板5.进口管6.排气口7.空气分布管8.温度调节器

9.转换器

第二十五页，共六十一页，2022年，8月28日唐菖蒲原球茎培养流程图

l.反应器2.蠕动泵3.培养液贮罐4.通气口5.培养板

6.支架7.加液口8.出波口9.加液、取液口

第二十六页，共六十一页，2022年，8月28日

培养马铃薯无菌芽的内环喷雾生物反应器A.培养容器B.内管C.转能器D.超声波发生器E.计时器F.液体培养基G.荧光灯H.支架I.不锈钢网J.植物材料K.空气出口L.空气过滤器

第二十七页，共六十一页，2022年，8月28日第二节动物细胞培养反应器应用细胞工程技术，建立大规模动物细胞培养系统生产各种生物活性物质，是一种比较经济可靠的技术。具有代表性的有气升式深层培养系统、微载体培养系统、微囊培养系统、大载体培养系统以及中空纤维培养系统。第二十八页，共六十一页，2022年，8月28日一、动物细胞培养方法体外培养的动物细胞有两种类型。一种是非贴壁依赖性细胞，可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。另一种是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量正电荷的固体或半固体表面上生长。第二十九页，共六十一页，2022年，8月28日l.贴壁培养培养贴壁依赖性细胞，最初采用滚瓶系统VanWezel在1967年开发了微载体系统培养贴壁依赖性细胞。第三十页，共六十一页，2022年，8月28日微载体系统培养动物细胞的优点①表面积／体积比大。②微载体悬浮于培养基中，细胞生长环境均一，简化了这些环境因素的监测和控制。③培养基利用率高。④采样重演性好。⑤收获过程不复杂。⑥放大较容易。⑦劳动强度小，占用空间小。影响微载体培养的特殊因素有微载体浓度、接种浓度和搅拌转速等。第三十一页，共六十一页，2022年，8月28日2.悬浮培养所谓悬浮培养，是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖性细胞培养。动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展起来的。由于动物细胞的特点，在许多方面又与经典的发酵不同。悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫能力。第三十二页，共六十一页，2022年，8月28日3.固定化培养悬浮培养适用于非贴壁依赖性细胞，贴壁培养适用于贴壁依赖性细胞。包埋培养，对两类细胞都适用，细胞生长的密度高，抗剪切力和抗污染能力强。对非贴壁依赖性细胞常用海藻酸钙包埋，对贴壁依赖性细胞常用胶原包埋。第三十三页，共六十一页，2022年，8月28日二、细胞培养的操作方式1.分批式操作2.流加式操作3.半连续式操作4.连续操作5.灌注培养第三十四页，共六十一页，2022年，8月28日三、动物细胞大规模培养反应器1．通气搅拌式细胞培养反应器根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器转动时产生的剪切力小，混合性能好。在已开发的各种形式搅拌器中，笼式通气搅拌器基本上能符合上述要求。该装置的主要特点是可以避免在向培养基中通气时气泡直接损伤细胞。同时在采用微载体系统培养时，微载体不会被由于通气所产生的泡沫滞留在气液界面中。第三十五页，共六十一页，2022年，8月28日

Spier设计的笼式通气搅拌器

第三十六页，共六十一页，2022年，8月28日

CelliGen笼式通气搅拌器

第三十七页，共六十一页，2022年，8月28日Celligen细胞培养反应器

第三十八页，共六十一页，2022年，8月28日2．气升式动物细胞培养反应器和搅拌式生物反应器相比，气升式反应器中产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；反应器内无机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；反应器通过直接喷射空气供氧，氧传递速率高；反应器内液体循环量大，细胞和营养成分能均匀分布于培养基中。第三十九页，共六十一页，2022年，8月28日1000L动物细胞培养流程图

第四十页，共六十一页，2022年，8月28日3．中空纤维细胞培养反应器

中空纤维细胞培养反应器在动物细胞培养方面用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞。一般来说，中空纤维是用聚矾或丙烯的聚合物制成。管壁的厚度约50～75μm，直径为200μm。管壁是半透膜。第四十一页，共六十一页，2022年，8月28日中空纤维细胞培养反应器美国Endotronic公司生产的Acusyst－JtTM中空纤维培养系统①培养器体积小，细胞高密度生长；②浓缩产品；③产物纯度高；④自动化程度高，细胞生长周期长。其缺点是由于中空纤维每次生产的消耗品价格尚贵，如果使用不当会增加生产成本。第四十二页，共六十一页，2022年，8月28日中空纤维培养系统（Acysyst－JrTM）循环简图

第四十三页，共六十一页，2022年，8月28日4．微囊培养系统微囊培养系统具有几个特点：①细胞密度大；②产物单位体积浓度高；③分离纯化操作经济简便；④抗体活性、纯度好。但微囊技术成功率一般只有50％左右，培养液用量大。囊内部分死亡细胞对产物的污染。第四十四页，共六十一页，2022年，8月28日

微囊技术操作过程图解1.悬浮细胞胶状液2.成滴器3.胶化小珠4.包被溶液5.显微镜下胶囊6.多孔微囊膜7.完成操作后的微囊第四十五页，共六十一页，2022年，8月28日5．大载体系统大载体培养系统是一种新型的大规模培养细胞装置，配有先进的主要部件，如溶解氧、pH测定以及培养液输入和产物的收获均由微机程控调节。该培养系统能连续生产3个月以上，已用于培养10多种有经济价值的细胞株，生产单克隆抗体和干扰素产品。我国于1987年引进上述大载体培养系统。第四十六页，共六十一页，2022年，8月28日大载体系统的优点①操作控制方便，可随机取样检测；②附着细胞密度高；③消耗用品价格低廉，产物收获量大，有明显经济效益。但该系统不具有细胞分泌产物的浓缩装置。第四十七页，共六十一页，2022年，8月28日

Be11co大载体培养系统组装简图

第四十八页，共六十一页，2022年，8月28日6．微载体培养系统基本原理是利用固体小颗粒作为载体，细胞在载体的表面附着，通过连续搅拌悬浮于培养液中，并形成单层生长、繁殖。由于扩大了细胞的附着面，能充分利用生长空间和营养液，因此大大提高了细胞的生长效率和产量。第四十九页，共六十一页，2022年，8月28日微载体培养系统的优点①具有较高的表面积体积比；②生长环境均一，条件易于控制，放大容易；③兼具贴壁培养和悬浮培养的优势，而且是均相培养；④取样和计数简单；⑤细胞和培养液易分离；⑥大规模培养只需对微生物搅拌式或气升式培养系统稍加改进即可；⑦适合于培养原代细胞、二倍体细胞株，它对生产重组产品来说是必不可少的有效方法。第五十页，共六十一页，2022年，8月28日微载体培养系统微载体是由天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）或者各种合成的聚合物组成的。其直径由50μm到数百μm不等。近年来国外开发的微载体主要有液体为载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、甲壳质微载体、聚酰胺泡沫为载体、藻酸盐凝胶微载体、新型的外被胶原的聚尿烷泡沫载体、磁性微载体。第五十一页，共六十一页，2022年，8月28日微载体培养系统

国际上微载体系统的研究开发，大体上沿着2个方向进行：①研究开发培养和收获细胞的新工艺、新设备包括自控和监测系统；②研制开发新型微载体。第五十二页，共六十一页，2022年，8月28日微载体培养系统

第五十三页，共六十一页，2022年，8月28日第三节微藻培养反应器一、微藻生物技术的优越性（1）光能利用率高。（2）微藻无复杂的生殖器官，整个生物量易于收获、加工和利用。（3）许多微藻经诱导后可以产生特别高浓度的、有商品化生产价值的化合物。（4）微藻通常没有有性阶段，只有简单的细胞分裂周期，能在数小时内完成细胞循环。第五十四页，共六十一页，2022年，8月28日二、微藻大规模培养的特点（1）微藻培养过程要有足够的光照。（2）气液传递：强化氧解析过程。（3）混合：在藻类培养过程中的混合除了具有促进气液传递、液固传递，防止细胞沉降作用外，还必须使细胞在与反应器的表面垂直的方向上能充分混合，否则培养液中的细胞受光不均匀。（4）培养液性质：培养基多采用海水配制第五十五页，共六十一页，2022年，8月28日三、微藻大规模培养反应器微藻培养用反应器要能提供以下条件：①足够的光照。②合适的温度。③合适的无机碳源（及其他无机营养物质）。④合适的PH。⑤充分混合。⑥避免污染。⑦氧的析出或供给。第五十六页，共六十一页，2022年，8月28日微藻大规模培养反应器敞开式培养反应器封闭式光生物反应器第五十七页，共六十一页，20