正清风痛宁注射液无菌检查方法适用性试验的研究

正清风痛宁注射液无菌检查方法适用性试验的研究

Summary目的：建立正清风痛宁注射液（2ml:50mg）无菌检查的方法，以确定其检验方法的准确性、有效性及重现性。方法：参照《中国药典》2015年版四部通则1101无菌检查法，采用薄膜过滤法对该品种进行无菌方法适用性试验。本次做3次试验，取样品，分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌的菌液，然后与其阳性对照组和阴性对照组对比；方法1中样品不加0.1%蛋白胨冲洗液，方法2样品加0.1%蛋白胨冲洗液2次（每次50ml）。实验结果显示：方法1不加0.1%蛋白胨冲洗液，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌的检品组都在第2-3天长菌，其阳性对照组第1天长菌，长菌时间不同，说明正清风痛宁注射液对这四种菌存在抑菌作用；方法2每膜加0.1%蛋白胨100ml冲洗2次（每次50ml），可去除抑菌作用，经方法学验证，可作为正清风痛宁注射液的无菌检验。Keys：正清风痛宁注射液；方法适用性；薄膜过滤法1概述正清风痛宁注射液由盐酸青藤碱[1]为主要成分，辅料为依地酸二钠、亚硫酸氢钠、注射用水。具有祛风除湿，活血通络，消肿止痛。用于风寒湿痹证，症见肌肉酸痛，关节肿胀、疼痛、屈伸不利，麻木僵硬及风湿与类风湿性关节炎具有上述证候者。根据2015版《中国药典》四部[2]通则1101无菌检查法中规定：当建立药品的无菌检查法时，应进行方法验证，以确定所采用的方法适用于该药品无菌检查的测定；当供试品为新的产品或供试品的检验条件发生改变时，检查方法应重新验证，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，以保证所污染的微生物能充分检出；此外，当检验方法的改变、检验方法的修订可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。1.1人员要求：进行方法验证的人员需有相关无菌知识背景，经过专门的无菌操作、无菌技术概念、微生物实验室相关的管理规范和操作规程的培训，具有无菌检查检查资格，方可进行无菌检查。1.2试验环境：阳性对照试验室为单独隔离的无菌检测间和缓冲间组成，结构和材料应符合要求。无菌检测间环境为D级背景的生物安全柜。室温18℃～26℃，相对湿度45%～65%；其中全过程必须严格遵守无菌操作。2实验材料2.1仪器和试剂2.1.1仪器表2-1主要实验仪器仪器型号编号超净工作台SW-CJ-2FDAYQ-AM-B-07生物安全柜BSC-1000ⅡA2YQ-AM-B-08集菌仪型号ZW-808AYQ-K-B-03隔水式电热恒温培养箱GHP-9270NYQ-H-B-08霉菌培养箱MJ-250F-1YQ-H-B-13立式压力灭菌器DMQ-0.3ⅢYQ-M-B-02无菌服、剪刀、手术镊、注射器、培养皿。以上物品洗净、晾干，用牛皮纸包扎严密，和无菌服于121℃蒸汽灭菌30min，备用。2.2培养基：硫乙醇酸盐流体培养基：按其使用说明配制，调节pH值分装，灭菌；胰酪大豆胨液体培养基：按其使用说明配制，调节pH值分装，灭菌；胰酪大豆胨琼脂培养基：按其使用说明配制，调节pH值，灭菌；沙氏葡萄糖琼脂培养基：按其使用说明配制，调节pH值，灭菌。以上培养基(北京三药科技开发公司提供)均要通过培养基质量检查。2.3稀释剂及冲洗液：0.1%蛋白胨溶液：按其使用说明配制，调节pH值分装，灭菌。0.9%无菌氯化钠溶液：氯化钠9.0g，加纯化水1000ml，加热使溶解分装，灭菌。2.4菌种及菌液制备2.4.1菌种：验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。本次验证试验用菌种为第三代[3]：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、生胞梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。2.4.2菌液制备：接种铜绿假单胞菌[4]、金黄色葡萄球菌[5]和枯草芽孢杆菌[6]的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中,35℃培养18～24小时。接种生孢梭菌[7]的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养物中，35℃培养18～24小时。接种白色念珠菌[8]的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，25℃培养24～48小时。接种黑曲霉[9]的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，培养5～7天。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成10倍稀释至10﹣5～10－7每lmL含菌数不超过100cfu的菌悬液备用（吸出孢子悬液时，用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)。菌液计数每种菌液接种2个平皿，取其平均值结果见表2-2表2-2各菌种菌落计数结果lmL含菌数不超过100cfu的菌悬液菌种名称菌种代数验证加菌数（CFU）铜绿假单胞菌380金黄色葡萄球菌376生孢梭菌368枯草芽孢杆菌372白色念珠菌360黑曲霉菌3502.5样品正清风痛宁注射液（生产单位：湖南正清制药集团股份有限公司；规格：2ml:50mg）；取3批，分别编号为样品1、样品2、样品3。3验证方法供试液制备：取样品30支，薄膜过滤[10]。3.1方法1：供试品组：取样品20支（每个批号共120支，分为6组，每组20支），过滤于封闭式滤器（2联筒/套），分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌的菌液（含菌数不超过100cfu/mL）即可，将相应的培养基分别加至全封闭的集菌培养器内，其中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生胞梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基，枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌用胰酪大豆胨液体培养基，每个集菌培养器中的培养基的装量为100ml。阳性对照组：不过滤供试品，加入等量试验菌（含菌数不超过100cfu/mL），其他它操作同检品组，作为阳性对照。阴性对照组：取未加样品的滤器，分别加入硫乙醇酸盐流体培养基3筒及胰酪大豆胨液体培养基3筒，100ml/筒，不加对照菌液，作为阴性对照。3.1.1培养结果：硫乙醇酸盐液体培养基置于30-35℃培养5天，胰酪大豆胨液体培养基置于20-25℃培养5天，逐日观察培养基中微生物生长情况并记录。表3-1培养基中微生物生长情况方法1描述取本品20支，用两联薄膜过滤器薄膜滤过，分别加入硫乙醇酸盐液体培养基及胰酪大豆胨液体培养基（100ml/筒）。硫乙醇酸盐液体培养基挑战菌名称样品与试验次数培养1d培养2d培养3d培养4d培养5d检品组（样品+菌液）金黄色葡萄球菌样品1－－+++样品2－－+++样品3－－+++铜绿假单胞菌样品1－－+++样品2－－+++样品3－－+++生孢梭菌样品1－++++样品2－++++样品3－－+++阳性对照组（菌液）金黄色葡萄球菌1+++++2+++++3+++++铜绿假单胞菌1+++++2+++++3+++++生孢梭菌1+++++2+++++3+++++阴性对照组－－－－－胰酪大豆胨液体培养基挑战菌名称样品与试验次数培养1d培养2d培养3d培养4d培养5d检品组（样品+菌液）白色念珠菌样品1+++++样品2－++++样品3+++++黑曲霉样品1－++++样品2－++++样品3－++++枯草芽孢杆菌样品1－++++样品2－－+++样品3－++++阳性对照组（菌液）白色念珠菌1+++++2－++++3+++++黑曲霉1－++++2－++++3－++++枯草芽孢杆菌1+++++2+++++3+++++阴性对照组－－－－－注:“+”表示长菌；“－”表示未长菌，培养基均澄清透明。结果：按方法1取本品20支，用两联薄膜过滤器薄膜滤过，分别加入硫乙醇酸盐液体培养基及胰酪大豆胨液体培养基（100ml/筒）；从上述验证结果中可见，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌的检品组都在第2-3天长菌，其阳性对照组第1天长菌。而白色念珠菌、黑曲霉的检品组和阳性对照组的长菌时间基本一致，表明正清风痛宁注射液对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌有一定的抑制作用，需要增加冲洗液的用量，去除抑菌成分，方法1不适合正清风痛宁注射液的无菌检验。3.2方法2：（对方法1中有抑菌作用的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌按方法2进行验证）供试品组：取样品20支（每个批号共80支，分为4组，每组20支），过滤于封闭式滤器（2联筒/套），每膜加0.1%蛋白胨100ml冲洗2次（每次50ml），在最后一次的冲洗中分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌的菌液（含菌数不超过100cfu/mL）即可，将相应的培养基分别加至全封闭的集菌培养器内，其中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生胞梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基，枯草芽孢杆菌用胰酪大豆胨液体培养基，每个集菌培养器中的培养基的装量为100ml。阳性对照组：不过滤供试品，加0.1%蛋白胨溶液100ml冲洗2次（每次50ml），在最后一次的冲洗中加入等量试验菌（含菌数不超过100cfu/mL），其他它操作同检品组，作为阳性对照。阴性对照组：取未加样品的滤器加0.1%蛋白胨溶液100ml冲洗2次（每次50ml）后，分别加入硫乙醇酸盐流体培养基4筒及胰酪大豆胨液体培养基2筒，100ml/筒，不加对照菌液，作为阴性对照。3.2.1培养结果：硫乙醇酸盐液体培养基置于30-35℃培养5天，胰酪大豆胨液体培养基置于20-25℃培养5天，逐日观察培养基中微生物生长情况并记录。表3-2培养基中微生物生长情况方法2描述取本品20支，用两联薄膜过滤器薄膜滤过，每膜加0.1%蛋白胨100ml冲洗2次（每次50ml），分别加入硫乙醇酸盐液体培养基及胰酪大豆胨液体培养基（100ml/筒）。硫乙醇酸盐液体培养基挑战菌名称样品与试验次数培养1d培养2d培养3d培养4d培养5d检品组（样品+菌液）金黄色葡萄球菌样品1+++++样品2+++++样品3+++++铜绿假单胞菌样品1+++++样品2+++++样品3+++++生孢梭菌样品1+++++样品2+++++样品3+++++阳性对照组（菌液）金黄色葡萄球菌1+++++2+++++3+++++铜绿假单胞菌1+++++2+++++3+++++生孢梭菌1+++++2+++++3+++++阴性对照组－－－－－胰酪大豆胨液体培养基挑战菌名称样品与试验次数培养1d培养2d培养3d培养4d培养5d检品组（样品+菌液）枯草芽孢杆菌样品1+++++样品2+++++样品3+++++阳性对照组（菌液）枯草芽孢杆菌1+++++2+++++3+++++阴性对照组－－－－－注:“+”表示长菌；“－”表示未长菌，培养基均澄清透明。结果：方法2取本品20支，用两联薄膜过滤器薄膜滤过，每膜加0.1%蛋白胨100ml冲洗2次（每次50ml），分别加入硫乙醇酸盐液体培养基及胰酪大豆胨液体培养基（100ml/筒）；验证结果中，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌的检品组都在第1天长菌，其阳性对照组也是第1天长菌，检品组和阳性对照组的长菌时间基本一致。4结论方法1不加0.1%蛋白胨冲洗液，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌的检品组都在第2-3天长菌，其阳性对照组第1天长菌，长菌时间不同，说明正清风痛宁注射液对这四种菌存在抑菌作用的，但作用较弱；方法2取本品20支，用两联薄膜过滤器薄膜滤过，每膜加0.1%蛋白胨100ml冲洗2次（每次50ml），可去除抑菌作用，经方法学验证，方法2准确可靠，可作为正清风痛宁注射液的无菌检验。Reference：[1]胡时灵,彭晓珊,谢志析,仇萍,张涛,廖端芳.盐酸青藤碱引发类变态反应的机制研究[J].西北药学杂志,2020,35(06):845-849.[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[S].医药科技出版社,2015:136-140.[3]徐全华,王羿.无菌药品生产环境微生物的鉴定和种群分析[J].中国药事,2019,33(12):1411-1418.[4]钱丽红,陶妍,谢晶.茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞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