精噁唑禾草灵复合污染体系微生物降解的

精噁唑禾草灵复合污染体系微生物降解的研究摘要：复合污染较之单一污染对环境的胁迫作用更为复杂。本实验中研究了外源物质百菌清、十二烷基苯磺酸钠和Cr+6与精噁唑禾草灵组成复合污染体系中微生物降解情况。结果表明：3种外源物质对产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv及Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）降解精噁唑禾草灵均产生了抑制作用。其中百菌清对Huv及产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）降解精噁唑禾草灵的抑制作用更为显著，而对于产碱菌属Alcaligenessp.H其相对抑制作用较小；当外源物质为十二烷基苯磺酸钠和Cr+6时，降解曲线形状发生了明显的变化，尤其降解初期十二烷基苯磺酸钠和Cr+6对降解菌的抑制作用尤为明显，降解速度很慢，随着降解菌对十二烷基苯磺酸钠和Cr+6的适应，降解速度逐渐加快。关键词：精噁唑禾草灵微生物降解外源物质抑制作用1.引言在环境污染体系中，不同的污染物质在不同介质中迁移、转归，不同污染物之间相互作用，形成复合污染体系。复合污染较之单一污染物对环境的胁迫作用更为复杂，复合污染问题已日益引起人们的关注。微生物由于其特殊的适应能力，一般来说同一种菌可能会对多种化合物有降解作用，而同时某一化合物往往同时会有多种降解菌。例如可降解DDT的细菌有节细菌属（Arthrobacter）、假单胞菌属（Pseudoimonas）、梭状芽孢杆菌属（Coslridium）、土壤杆菌属（Agrobacterium）[1、2]。精噁唑禾草灵是由德国Hoechst（现归并于德国Bayer）公司,开发出来的一种防除禾本科杂草的高效茎叶选择性低毒除草剂[3]，主要用于麦田防除野燕麦、看麦娘等多种禾本科杂草，具有施药适期长、防效好、对小麦安全等特点，目前在我国使用很广[4]。目前国内外对精噁唑禾草灵的报道主要集中在使用方面，尽管精噁唑禾草灵属于低毒除草剂，但关于精噁唑禾草灵的环境行为国内外报道很小，尤其是精噁唑禾草灵在土壤以及水体中微生物降解以及迁移转化情况。本实验中所选的三种外源物质分别为百菌清、十二烷基苯磺酸钠和Cr+6，在农田及污染水体中，它们均可与精噁唑禾草灵组成复合污染体系。因此研究细菌Alcaligenessp.H、Huv和Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）在复合污染中对精噁唑禾草灵的降解情况，在于进一步了解环境中微生物对精噁唑禾草灵的降解性能、降解机理，以及降解产物给环境带来的可能影响，同时可以为实际环境中精噁唑禾草灵的污染治理提供技术支撑。2.材料与方法2.1菌株产碱菌属Alcaligenessp.H，安徽农业大学农药研究所提供Huv（Alcaligenessp.H紫外诱变菌株），安徽农业大学农药研究所提供2.2基础无机培养液MgSO4.7H2O0.2g/FeSO4.7H2O0.001g/K2HPO40.1g/(NH4)2SO40.1g/CaSO40.04g/蒸馏水1000mL/pH=7.02.3供试药品及试剂精噁唑禾草灵标样：安徽华星化工有限公司提供,纯度为99.0％；百菌清标样（安徽农业大学农药研究所提供），纯度为98.0％；十二烷基苯磺酸钠（北京市联利生物制剂厂）,纯度为99.0％；重铬酸钾（上海试剂一厂），分析纯2.4.精噁唑禾草灵的分析方法2.4.1精噁唑禾草灵的提取将无水乙醇3.5mL加入盛有1.5mL精噁唑禾草灵培养液的试管,充分振荡,使没有被微生物利用的精噁唑禾草灵充分溶解于乙醇和水的混合物中(精噁唑禾草灵于水中的溶解度低,为0.7mg/L,但在乙醇中溶解度＞10g/L,又因为乙醇同水可任意比例混合,所以采用此法),将上述混合液用针筒式微孔滤膜过滤器过滤于5mL容量瓶,定容后测定。2.4.2精噁唑禾草灵的液相色谱分析条件及液相色谱图仪器:Agilen1100serises带紫外可变波长检测器VWD条件:流动相为甲醇：水，85：15(体积比)；流速:1mL/min；检测波:236nm；C18柱(4.6×250mm)；压力:100±5bar；温度:25℃；精噁唑禾草灵的保留时间:5.70min3.结果与分析3.1百菌清对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响百菌清对产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv和产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）降解精噁唑禾草灵均产生了抑制。通过比较产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv和产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）半衰期和降解速率常数（相对于无百菌清的介入情况下），可以看出百菌清对Huv及产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）降解精噁唑禾草灵的抑制作用更为显著；而对于产碱菌属Alcaligenessp.H相对抑制作用较小。（图2及表1）3.2十二烷基苯磺酸钠对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响十二烷基苯磺酸钠对产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv菌及产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）的降解，均产生了抑制作用，降解曲线形状发生了明显的变化，由向上趋势变为向下的趋势，尤其降解初期，十二烷基苯磺酸钠对细菌的抑制作用尤为明显，降解速率很小，随着细菌对十二烷基苯磺酸钠的适应，降解速率逐渐增。通过比较产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv菌及产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）半衰期，其半衰期分别为87.82h（64.17h）、41.50h（35.18h）、49.15h（30.39h），可知十二烷基苯磺酸钠对产碱菌属Alcaligenessp.H菌的降解抑制作用较为明显。（图3及表2）图1.精噁唑禾草灵的液相色谱Fig1.TheHighPerformanceLiquidChromatogramoffenoxaprop-p-ethyl3.3铬离子对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响Cr+6对产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv菌及产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）的降解同样产生了明显抑制作用，降解曲线形状发生了明显的变化，其变化趋势与外源物质为十二烷基苯磺酸钠接近。通过比较产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv菌及产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌（1：1）的半衰期和降解速率常数，可知Cr+6对产碱菌属Alcaligenessp.H菌的降解抑制作用尤为明显。（见图4及表3）3.4综合比较比较三种外源物质对产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv菌及产碱菌属Alcaligenessp.H与.Huv混合菌（1：1）降解10mg/mL精噁唑禾草灵的半衰期（见表4），可知对于产碱菌属Alcaligenessp.H菌来说，Cr+6对其的抑制作用最大，其半衰期增加了近一倍；对于Huv来说，百菌清对其的抑制作用最大；而对于混合菌来说，Cr+6对其的抑制作用最大。通过上述比较，可知不同的外源物质对不同的菌产生不同的作用，因此在不同的污染体系中，应针对不同的污染体系选择不同的降解菌或降解菌体系。本实验中筛选的产碱菌属Alcaligenessp.H菌及Huv菌，可以为环境中不同的精噁唑禾草灵污染体系提供菌株选择。图2.百菌清对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响Fig2.EffectofchlorothalonilondegradationFenoxaprop-p-ethylbydifferentstrains图3.十二烷基苯磺酸钠对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响Fig3.EffectofDodecylbenzenesulfonicaidsodiumsaltondegradationFenoxaprop-p-ethylbydifferentstrains图4.铬离子（六价）对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响Fig4.EffectofCr+6ondegradationFenoxaprop-p-ethylbydifferentstrains注：上述三个实验中:精噁唑禾草灵浓度均为:10mg/L；百菌清,十二烷基苯磺酸钠,Cr+6浓度均为:10mg/L系列1：Alcaligenessp.H；系列2：.Huv；系列3：Alcaligenessp.H：Huv（1：1）；系列4：Alcaligenessp.H（对照）；系列5：Huv（对照）；系列6：Alcaligenessp.H：Huv（1：1）（对照）表1.百菌清对不同菌降解精噁唑禾草灵影响的动力学参数Table1.KineticdataofbiodegradationofFenoxaprop-p-ethylwithchlorothalonilbydifferentstrain菌株Strain菌量OD330回归方程Ct=C0e-kt相关系数r速率常数半衰期（h）H(对照)0.2Ct=10.016ee-0.01108x0.99370.010864.17Huv(对照)H：Huv(1：11)(对照)0.20.2Ct=9.69776e-0..0197xxCt=9.5947ee-0.02228t0.98290.99600.01970.022835.1830.39H0.2Ct=10.05ee-0.00095x0.98940.009572.95Huv0.2.Ct=9.61899e-0.00131x0.97390.013152.90H：Huv(1：11)0.2Ct=10.021ee-0.01132x0.99870.013252.50表2.十二烷基苯磺酸钠对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响的降解动力学参数Table2.KineticdataofbiodegradationofFenoxaprop-p-ethylwithDodecylbenzenesulfonicaidsodiumsaltbydifferentstrain菌株Strain菌量OD330回归方程Ct=C0e-kt相关系数r速率常数半衰期（h）H(对照)Huv(对照)H：Huv(1：1))(对照)HHUVH：Huv（1：1）Ct=10.016ee-0.01108xCt=9.6976ee-0.01197xCt=9.5947ee-0.02228tCt=10.807ee-0.00079xCt=10.632ee-0.01167xCt=11.492ee-0.01141x0.99370.98290.99600.92500.98940.92350.01080.01970.02280.00790.01670.014164.1735.1830.3987.7241.5049.15表3.铬离子对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响的降解动力学参数Table3.KineticdataofbiodegradationofFenoxaprop-p-ethylwithCr+6bydifferentstrain菌株Strain菌量OD330回归方程Ct=C0e-kt相关系数r速率常数半衰期（h）H(对照)Huv(对照)H：Huv(1：1))(对照)HHUVH：Huv（1：1）Ct=10.016ee-0.01108tCt=9.6976ee-0.01197tCt=9.5947ee-0.02228tCt=10.55ee-0.0006tCt=11.218ee-0.01148tCt=11.082ee-0.01118t0.99370.98290.99600.95430.94560.94310.01080.01970.02280.0060.01480.011864.1735.1830.39115.5046.8258.73表4.不同菌降解加入不同外源物质的精噁唑禾草灵的半衰期Table4.T1/2ofdegradationfenoxaprop-p-ethylbydifferentstrainswithdifferentmaterials菌株StrainT1/2对照（h）T1/2(百菌清))（h）T1/2(十二烷基基苯磺酸钠)（h）T1/2(Cr++6)（h）HHuvH：Huv（1：1）64.1735.1830.3972.9552.9052.5087.8241.5049.15115.5046.8258.734.结论4.1百菌清对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响杀菌剂对细菌的杀死或抑制作用主要表现为抑制能量代谢或干扰呼吸作用，阻止ATP的产生、干扰有机体生长和维持生命所需新细胞物质的产生过程以及破坏细胞结构，影响细胞膜的通透性而导致细胞内含物泄漏三个方面[5]。在本实验中，百菌清（作为一种常用杀菌剂）对产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv菌及产碱菌属Alcaligenessp.H和Huv混合菌降解精噁唑禾草灵均产生了抑制作用，说明了百菌清对产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv菌及产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌均有杀灭作用，这与杀菌剂的性质相符。通过比较，百菌清对Huv降解精噁唑禾草灵的抑制作用更为显著，而对于产碱菌属Alcaligenessp.H相对抑制作用较小。通过降解实验中（降解菌为Alcaligenessp.H），液相色谱测定过程中百菌清峰高（测定精噁唑禾草灵液相色谱下，百菌清的保留时间为4.0min）下降，可知产碱菌属Alcaligenessp.H对百菌清同样有降解作用，这同时又说明产碱菌属Alcaligenessp.H菌对百菌清有较好的适应性。4.2十二烷基苯磺酸钠对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响表面活性剂是在较低量时便能降低溶液界面张力、改变体系界面活性的一种物质[6]。十二烷基苯磺酸钠是一种阴离子表面活性剂，在水溶液中能较迅速地降解为烷基酚、烷基苯羧酸等中间代谢产物，因而也是污染土壤和地下水的主要成分之一。张丽芳等[7]分别研究了阴离子及非离子表面活性剂对不同石油降解菌除油影响的研究，表明阴离子及非离子表面活性剂均对细菌除油率产生影响，其中阴离子表面活性剂（十二烷基苯磺酸钠）对细菌活性具有明显的抑制作用，非离子表面活性剂（曲拉通X-102）也有抑制作用。有关表面活性剂的抑制或毒性作用可能有两种[8]:(1)表面活性剂与细胞膜的脂质物质相互作用,而破坏了细胞膜；(2)表面活性剂与酶或其他影响细胞基本功能的蛋白质发生了反应。表面活性剂对细菌的毒性随着碳氢链的增长而增长。本试验中十二烷基苯磺酸钠可能与产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv发生了上述两种作用,从而使产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv及产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌降解精噁唑禾草灵效率下降。4.3重金属对不同菌降解精噁唑禾草灵的影响重金属能够明显影响土壤的微生物群落,如能降低土壤微生物生物量[9],降低活性细菌菌落的数量[10]等等。同时，重金属污染亦能明显影响土壤微生物群落结构[11],即土壤微生物系统的反应。已有研究表明，微生物群落结构的变化能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标[12]。Cr+6对产碱菌属Alcaligenessp.H、Huv菌及产碱菌属Alcaligenessp.H与Huv混合菌降解精噁唑禾草灵均产生了抑制作用，尤其降解初期Cr+6对细菌的抑制作用更强，降解速率很小，随着细菌对其的适应，降解速率逐渐增大。这是因为，重金属（Cr+6）作为蛋白质的沉淀剂，可以与细菌酶的-SH基结合，使酶失活，或与菌体蛋白结合，使之变性或沉淀。5.致谢本研究得到国家自然科学基金项目资助（20277001）参考文献1.Pemberton,J.M.,Wynne,E.C.Geneticengineeringandbiologicaldetoxification/degradationofinsecticides,ininsecticideMicrobiology,ed.ByR.Lal.1984,P147-1682.GuenziW.D.PesticidesinsoilandWater.Soilsci.Soc.Amer.Inc.Publisher,Madison,Wiscosin,1974,P133-1513农药部农药检定所主编，新编农药手册（续集）,北京：农业科学出版社出版，1998,P362-3634张宗俭，耿贺利.恶唑禾草灵与阔叶杂草防除剂的混用药效研究.农药,1997.36（8）：40-435韩熹莱主编,农药概论.北京：北京农业大学出版社出版.,1995年第1版，P84-926梁治平,宗志娟,李金华编.功能性表面活性剂.北京：中国轻工出版社.2000,P1-167张丽芳，姜承志，李东辉.表面活性剂对不同石油降解菌除油影响的研究.沈阳工业学院学报，2001（4）：80-848ShonallLaha,RichardGLuthy.Inhibitionofphenananthrenemineralizationbynonionicsurfactantsinsoil-watersysterms[J].EnvironSciTechno,1991,25(11):1920-19299BrookesPC,McGrathSP.Effectsofmetaltoxicityonthesizeofthesoilmicrobialbiomass[J].JournalofSoilScience,1984,35:341-34610JordanMJ,LeChevalierMP.Effectsofzinc—smelteremissiononforestsoilmicroflora[J].CanadaJournalofMicrobiology,1975,21:1855-186511PennanenTA,FrostgardHFritze,BaathE.Phospholioidfattyacidcompositionandheavymetaltoleranceofsoilmicrobialcommunitiesalongtwoheavymetalpollutedgradientsinconiferousforest[J].AppliedEnvironmetalandMicrobiology,1996,62:420-42812孙波，赵其国.土壤质量评价的生物学指标[Ｊ].土壤,1997,29(5):225—234BiodegradationResearchonFenoxaprop-p-ethylCombinedPollutionsystemAbstract:Combinedpollutionsystemiscomplexthansingle-polutionsystem,andmoreandmoreattentionisfocusingonit.Inthispaper,wediscussthecombinedpollutionsystemwhichwasconsistofChlorothalonil,dode