化学生物学导论-课件第一章蛋白质protein

第一章蛋白质Protein蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。蛋白质不仅是构成人体一切组织的主要成分，更为重要的是，它与生命活动有着相当密切的关系。如调节生理功能的激素，参加营养代谢的酶，运载氧的血红蛋白，抵抗疾病的抗体等，均以蛋白质为主要构造材料。还有人体酸碱度的调节、体液的平衡、遗传信息的传递等，也与蛋白质有关。第一节 蛋白质的结构组成蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物学科中经常涉及的分析内容，也是临床诊断和检验疾病治疗效果的重要指标，还是药物和食品分析的常见项目。那么，如何测试一个样品中蛋白质含量和组成呢？

一、蛋白质的元素组成

蛋白质是一类含氮有机化合物，大多数蛋白质还含有少量的硫，有的含有磷，少数还含有铁、铜、锰、锌、钼等金属元素，个别的蛋白质还含有碘等。

元素百分含量平均（%）CHONSP50556.97.7212415.017.60.32.30.40.9527231620.6大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，在任何生物样品中，每克氮的存在，大约表示该样品含有100/16=6.25克的蛋白质，故可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量。蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数

6.25100对微量分析而言，蛋白质内源光谱在灵敏度方面常常不能满足需要，为此，人们发展了各种光谱探针分析方法。蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。蛋白质的定量分析方法很多，如电化学探针、发光探针等，但研究最多、应用最广的还是吸光光度法、荧光分析法和共振光散射等分子光谱探针。这里仅介绍几种常见的测试方法。（1）双缩脲法双缩脲法是一种测定蛋白质的经典方法，双缩脲反应是双缩脲在碱性溶液中与铜离子(Cu2+)生成紫红色化合物的反应。具有2个或2个以上肽键的化合物都有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中也能与Cu2+

生成紫红色化合物，可在540nm测量吸光度。（2）Folin-Lowry法Lowry等将双缩脲试剂和Folin酚试剂（磷钼酸盐磷钨酸盐）结合使用，在蛋白质发生双缩脲反应之后，再和Folin酚试剂反应，此试剂在碱性条件下被蛋白质中酪氨酸的酚基还原，生成颜色更深的化合物，可在640nm测量吸光度。该方法法比双缩脲法灵敏100倍，其不足之处是此反应受多种因素干扰，且由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸含量不同，在显色灵敏度方面存在差异。本法可测定范围是25—250g蛋白质。（3）考马斯亮蓝G-250法

在酸性条件下，染料考马斯亮兰G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)与蛋白质结合后，其吸收高峰从465nm移至595nm处，由棕黄色转为深兰色。因蛋白质与染料生成复合物颜色的深浅与其浓度成比例关系，可作为测定蛋白质浓度的方法。该方法使用方便，反应时间短，染色稳定，且对显色时间不严格要求，并有抗干扰性强的特点，为常用的蛋白浓度测定方法。该法的线性范围为1～20μg/mL，灵敏度高于Lowry法、溴酚蓝法和溴甲酚绿法，成为灵敏度最高的染料探针分析方法。

蛋白质的组成分析最初分离得到的蛋白质，人们根据元素分析知道蛋白质是一类含氮有机化合物，除了含有碳、氢氧、氮以外，还含有少量的硫。因此，采用化学水解手段对蛋白质进行处理，对蛋白质的组成进行分析，完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。（1）酸水解常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。（2）碱水解一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。水解产物的分析一、氨基酸分子中含有氨基的脂肪酸均称为氨基酸。作为蛋白质结构单元的氨基酸均为L--氨基酸。天然蛋白质由20种基本氨基酸组成，有少数蛋白质还含有若干种不常见的氨基酸，它们都是基本氨基酸的衍生物。

不同的氨基酸在于

R基团的不同1，氨基酸的结构和分类

从蛋白质水解产物中分离得到的基本氨基酸中，除不含手性碳原子的甘氨酸和含有环状二级氨基的脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。

脂肪族氨基酸

含羟基、含硫氨基酸、环氨基酸

芳香族氨基酸、碱性氨基酸

酸性氨基酸及其酰胺LeuL-C-C-CONH2-C-CONH2-C-COOH-C-C-COOH-H-CH3-C-OH-C-SH-C-C-S-CPPro-C-CCNN+

-C-C-C-C-NH3+-C--C--OH-C-NSouthlineCircularlineCentrallineNan-KanlineChung-SanlineNorthwestlineAliphaticAmideAcidicImino,CircularBasicSulfurHydroxyAromatic-C-C-C-N-C-N

N+=

C-C-C-C

C-C-C-C

CC-C

CCCHNC-COOH

a-C-C

OHGlnQAsnNAspDGluEPheFArgRLysKHisHGlyGAAAlaVValI

IleYTyrSerSThrTMetMCysC氨基酸R基团化学结构TrpW第21-22种氨基酸蛋白质的生物合成是生命活动的重要组成部分，通常蛋白质由20种氨基酸组成。自然界传统的三联体密码共有64个，其中61个用来编码20种标准氨基酸，另外3个UAA,UAG,UGA为终止密码子，指导蛋白质翻译的终止。1986年，第21种参与蛋白质生物合成的氨基酸-硒代半胱氨酸被发现，它由终止密码子UGA直接编码。2002年，由另外一个终止密码子UAG编码的第22种氨基酸吡咯赖氨酸在古细菌中发现。

硒代半胱氨酸

2，几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。4-羟基脯氨酸5-羟基赖氨酸6-N-甲基赖氨酸3,5-二碘酪氨酸3，非蛋白氨基酸

除了上述构成蛋白质的氨基酸以外，自然界还存在一些并不是蛋白质组分的氨基酸，这些氨基酸通常被称为非蛋白氨基酸，至今已经发现200多种以上，它们具有不同的功能。

某些非蛋白氨基酸的结构与功能

-丙氨酸：泛酸及辅酶A的组成成分-氨基丁酸：存在与脑组织中的神经递质高半胱氨酸：甲硫氨酸生物合成的中间产物高丝氨酸：氨基酸代谢的中间产物鸟氨酸：尿素生成过程的中间产物瓜氨酸：苯甘氨酸：抗菌素构成成分(MicakgcinB)氨基酸工业及其应用20种氨基酸中，其中8种为人类必需的氨基酸-体内不能合成，需要从食物中摄取-苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸，这8种氨基酸中，又有3种为支链氨基酸。由于20种氨基酸是构成蛋白质的基本单位，所以氨基酸及其衍生物广泛应用于医药、食品、添加剂、化妆品、科学研究等领域，已经形成了一个较大的氨基酸工业。氨基酸合成方法目前氨基酸的合成方法有5种：（1）直接发酵法；（2）添加前体发酵法；（3）酶法；（4）化学合成法；（5）蛋白质水解提取法。通常将直接发酵法和添加前体发酵法统称为发酵法。γ-聚谷氨酸γ-聚谷氨酸是一种水溶性，生物降解，不含毒性，使用微生物发酵法制得的生物高分子。在“纳豆”—发酵豆中被首次发现。用γ-PGA与聚乙二醇合成的交联物是可生物降解的具有三维网状结构的高分子材料,可吸收自身质量数百倍至1000倍的水量,吸水后膨胀,加压后水分不会脱去,是一种保水性材料。纳豆1g吸水1700g我国氨基酸工业的发展现状目前，我国已经成为氨基酸生产和消费大国，年消费量约300多万吨（其中谷氨酸钠即味精就达200万吨）。我国氨基酸生产发展快速的主要有谷氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸等。氨基酸生产方法和产量氨基酸生产方法产量氨基酸生产方法产量味精发酵I精氨酸发酵，提取III赖氨酸发酵I谷氨酰胺发酵III蛋氨酸化学合成I脯氨酸发酵III苏氨酸发酵II缬氨酸发酵III色氨酸发酵II异亮氨酸发酵III甘氨酸化学合成II亮氨酸发酵,提取III苯丙氨酸发酵II组氨酸发酵,提取III天冬氨酸酶法II丝氨酸发酵,提取III丙氨酸酶法III酪氨酸发酵,提取III半胱氨酸胱氨酸还原III天冬酰胺提取III类型I:500,000-3000,000t/a;类型II:10,000-100,000t/a;类型III:100-10,000t/a二、氨基酸的性质除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据1，氨基酸的旋光性2，氨基酸的光吸收构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;3，氨基酸的离解性质氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。甘氨酸的酸碱滴定曲线谷氨酸的酸碱滴定曲线组氨酸的酸碱滴定曲线4，氨基酸的等电点

当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2

同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-

)/2

硷性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2第二节多肽一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。一、多肽的结构由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。多肽的形成与结构

在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：

Ser–Gly–Tyr–Ala–Leu二、肽键肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。四肽的结构三、多肽的性质

多肽分子中含有游离的末端氨基和羧基，氨基酸残基的侧链上也含有可离解基团，因此，多肽可以看成是一个“大氨基酸”。多肽在水溶液中也以两性离子的形式存在，有等电点。在等电点时，正离子数目与负离子数目相等，净电荷为零。等电点的高低，主要取决于侧链上的碱性和酸性基团的相对数目。

1，多肽的两性离解

2，多肽链的水解

多肽的肽键与一般的酰胺键一样，可以被酸或碱水解，也可以被酶水解。根据多肽水解程度的不同可以分为完全水解和部分水解。完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解。

四、天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。鹅膏覃碱Met-脑啡肽Leu-脑啡肽牛催产素（九肽）

短杆菌肽S(环十肽)

谷胱甘肽-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，简写为GSH，是广泛存在于动物和植物细胞中的一种三肽，在生物体内发生的氧化还原反应中起重要作用。它有两种存在形式，即还原型和氧化型：

合成的肽甜味二肽

阿斯巴甜-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯，白色结晶，稀溶液的甜度约为蔗糖的100～200倍。

纽甜（Neotame）N-[N-（3,3-二甲基丁基）-L-α-天门冬氨酰]-L-苯丙氨酸1-甲酯。

第三节蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。蛋白质结构非常复杂，1969年国际纯化学与应用化学联合会（IUPAC）对蛋白质高级结构的不同层次作了界定主要包括以肽链线性结构为基础的一级结构，以及由肽链卷曲、折叠而形成的三维结构-蛋白质的二级、三级和四级结构。一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primarystructure)包括组成蛋白质的多肽链数目.多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。牛胰核糖核酸酶的一级结构

二、蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构是指肽链的主链在空间的排列。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。肽链主链的构象是由肽键的特殊结构决定的。组成肽键的原子都处于同一平面。在肽链中，两个相邻的肽键通过一个共同的-碳原子相连接。由于C-N和C-C键可以自由旋转，因此，在保持肽键平面结构不变的条件下，能够形成不同的空间排列。

二面角（ф，ψ）一个肽平面围绕N1-C旋转的角度用ф表示；另一个肽平面围绕C-C2旋转的角度，用ψ表示。这两个旋转角度叫二面角。一对二面角（ф，ψ）决定了与一个-碳原子相连的两个肽平面的相对位置

肽平面的几种不同的构象类型

蛋白质二级结构的类型维持主链空间排列的另一个重要因素是氢键。主链中的-C=O和-N-H能够相互形成链内或链间的氢键。在各种可能的构象中，能够形成氢键最多的构象最稳定。蛋白质二级结构主要有-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲。多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。蛋白质分子为右手-螺旋。（1）-螺旋肽链-螺旋结构的四种表示方法

-螺旋（2）-折叠-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm；-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。（2）-折叠蛋白质-折叠结构的顺反形式

（3）-转角-turn在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。蛋白质的两种主要-转角结构

由于甘氨酸和脯氨酸结构的特殊性，常常出现在-转角结构中。

无序蛋白无序蛋白(disorderedproteins)，也称天然未折叠蛋白(nativelyunfoldedproteins)或内在无结构蛋白(intrinsicallyunstructuredproteins,IUPs)，指该蛋白质在体外中性pH条件下缺乏有序结构，即特定的三级结构。无序蛋白是构成真核生物蛋白质的一大部分，约占总蛋白质的30％。无序蛋白通常具有生物功能，这也是对“功能蛋白质通常需要一个稳定的高级结构(三级或四级)”这一传统观念的巨大挑战。

根据所含无序结构的多少，可将无序蛋白分为两大类：完全无序蛋白(全序列无序)和部分无序蛋白(局部超过30-40个残基的区域无序。完全无序蛋白又可分为完全不含二级结构和含部分二级结构两种。1-5：部分无序蛋白；6-7：完全无序蛋白0:有序蛋白无序蛋白的结构特征：1，含有大量重复序列；2，通常具有较高的亲水性和带电性。无序蛋白的功能通常涉及到与其相应配体的结合，这些配体如蛋白质、核酸，而且这种结合常常是在其无序结构进行一定折叠后所诱导的。到目前为止，所发现的无序蛋白功能已超过30种，其中伴侣分子是最能体现无序蛋白功能的一类分子。伴侣分子通常参与RNA和蛋白质分子的折叠过程，而其中的无序区域起着关键作用，删除或替代这些区域常使伴侣分子丧失功能。三、蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构(TertiaryStructure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。生物体内蛋白质的类型球状蛋白质-主要是可溶性蛋白，存在与细胞质中。纤维状蛋白质-主要是细胞骨架类蛋白，存在于细胞间，细胞内，细胞器内。膜蛋白-主要是细胞上的受体蛋白，转运蛋白和通道蛋白。1，超二级结构在某些具有特殊功能的球状蛋白质分子中，常常出现许多相邻的二级结构单元按照一定规律、规则地组合在一起，彼此相互作用，形成在空间构象上有区别的二级结构组合单位，称为超二级结构。它可以作为构成三级结构的元件。超二级结构有（两个-螺旋互相缠绕构成）、（两个-折叠通过一段肽链连接）、（三段-折叠链和两段-螺旋组成）和（三条反平-折叠通过-转角连接）等几种类型。结构域（structuraldomain）对于一些相当大的蛋白质分子，一条长的多肽链，有时要先分别折叠成几个相对独立的区域，再组装成球状或颗粒状的复杂构象（三级结构）。这种在二级结构或超二级结构基础上形成的特定区域称为结构域（structuraldomain）。每个结构域自身都是紧密装配的，但结构域之间的联系是比较松散的，因此在两个结构域间常常形成空穴。不同的蛋白质，其结构域的数目各不相同。蛋白质分子分成几个结构域的现象，通常与蛋白质的功能有关。2，三级结构的折叠类型

以结构域为单位，根据二级结构的类型、数量、组合方式等，三级结构主要有以下几种类型。（1）全类型:蛋白质结构中的二级结构以-螺旋为主，各段-螺旋通过反平行或近于相互垂直的状态连接，排列成层，再平行叠起，从而形成三级结构的构象基础。（2）平行/类型

整个肽链中-螺旋与-折叠交替存在，卷曲组成多层，一般平行的-折叠片层在结构域的内部，-螺旋覆盖在外部，实际上是超二级结构的进一步连接扩充，大多数卷曲成右手交叉连接。（3）反平行类型:主要由-折叠片层反平行排列形成，链之间以-转角连接，或者以跳过相邻链的条带而进行连接。常见的希腊花边桶的链呈反时针方向盘绕，桶的相对两边链呈右手交叉连接。（4）不规则结构类型：许多小蛋白质立体结构不规则，其中正规的二级结构单元较少，没有上述几种结构类型。有些蛋白质富含金属元素，有些富含二硫键。

3，多结构域蛋白质

大分子的蛋白质往往具有多个结构域，其三级结构是在结构域构象的基础上通过肽链连接形成的。免疫球蛋白G-晶体蛋白四、蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构(QuaternaryStructure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。蛋白质的四级结构主要涉及具有三级结构的多肽链聚合形成蛋白质时的空间排列方式和相互作用。许多天然球状蛋白质多是由两条或多条肽链构成的，在这些蛋白质分子中，肽链之间没有共价键连接，每条肽链各自具有一、二、三级结构。1，寡聚蛋白的亚基数目

这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位（Subunit），它一般由一条肽链构成，无生理活性；维持亚基之间的化学键主要是疏水力。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。

蛋白质亚基数目醇脱氢酶2苹果酸脱氢酶2醛缩酶33-磷酸甘油醛脱氢酶4乳酸脱氢酶4血红蛋白4谷氨酸合成酶12蕃茄株低矮病毒外壳蛋白1802，寡聚蛋白亚基的排列方式球状蛋白三级结构的主要特征绝大多致的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦具有三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，内部的空间约有75％被原子所充满。1,存在于蛋白质内部主要是一些非极性残基的侧链，约有63％是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、有氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等；带电的残基，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有4％。约95％的带电的侧链是分布在蛋白质的表面；约14％的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。2,原则上，一些相对规则的-螺旋和-折叠分布在球状蛋白的内部，而且压积得很紧密，致使球状蛋白成为致密的结构；那些连接-螺旋和-折叠叠的规整性相对差一些的二级结构，转角和环状以及特定的“无规”卷曲，则更多地是分布在球状蛋白的外周。3,在很多蛋白质分子的内部还存在着数量不同的水分子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性的原子形成氢键。其中一些水分子也参与了蛋白质功能的行使。4,球状蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，经常会出现一些“裂隙”或“洞穴”，在“裂隙”或“洞穴’’的周围常常是疏水性的：这些“裂隙”或“洞穴”可能是蛋白质(酶)的活性部位所在。5，对于蛋白质来说，为了维持蛋白质分子的构象和功能，其分子的周围必须存在一个水层。至于需要多少水才能保持蛋白质的活性,则取决于蛋白质的分子大小、形状、表面电荷、疏水及亲水性质等。蛋白质分子周围存在的水分子可以分为两类：一类是与蛋白质紧密地结合的“结合水”；结合水是直接与蛋白质分子相互作用的一类水分子（主要是以氢键形式与蛋白分子结合），对蛋白质构象的形成和维持等起着关键的作用。另一类是与蛋白松散结合起溶剂作用的“大量水”。大量水主要是作为溶剂起作用，虽然对维持蛋白的活性也很重要，但可以部分被有机溶剂等取代。6,蛋白质中的部分二级结构并不是永久不变的，由于在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子的表面也常见到一些疏水的残基。这些“异常”分布的残基，致使肽链的局部结构发生“扭曲”，从而相对地处于较不稳定的状态，有时可随着环境因素的变化而进行结构的转换。如酶的底物，小分子化合物以及酸碱、金属离子等。疯牛病(MCD)-朊蛋白而蛋白质与配体（底物、药物等）结合时，蛋白质核心部分的结构在结合前后基本不变，以维持蛋白质整体结构的稳定性。只有少数的局部区域(柔性区域)会在与配体结合时，构象作出适应性的变化，产生“诱导契合效应”，以利于蛋白质和配体的高度选择性的结合。谷氨酸受体与谷氨酸结合过程中的构象变化乳铁蛋白在与Fe离子结合过程中构象变化硫氧还蛋白

的结构紧密结合水亲水性残基疏水性残基溶菌酶的结构肌红蛋白的结构第四节、化合物质与蛋白质的相互作用在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。在药物以及化学生物学研究中，药物、酶的底物或小分子探针等常常与蛋白质发生较为专一性的相互作用。药物与蛋白激酶乳酸脱氢酶与底物一、蛋白质表面水层被破坏1，当向蛋白质溶液中加入高浓度的无机盐时，盐与水分子结合，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，就越易产生沉淀。如盐析-硫酸铵沉淀。2，水互溶性有机溶剂浓度达到一定浓度时，在疏水区域附近近有序排列的水分子可以被有机溶剂所取代，导致蛋白质分子聚集而沉淀。最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在20%-50%（V/V））之间。浓度过高会使蛋白质表面的结合水失去，导致其失去活性。3，许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。一般PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20000。所用的PEG浓度通常为20%，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。

二、改变蛋白质表面电荷分布1，由于酸性、碱性氨基酸多数分布在蛋白质表面，溶液pH的改变会导致表面电荷的状态，造成蛋白质溶解度降低而沉淀，也会造成亲水性变化，使其构象变化，生物活性发生改变或丧失。如等电点沉淀，有机酸沉淀，pH对酶催化的影响等。pH对-乳球蛋白溶解度的影响

2，聚电解质（高分子化合物），如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等，一些阴离子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和以聚苯乙烯为骨架的季胺盐。它们通过静电引力与蛋白质表面的相反电荷作用，改变了其表面的电荷状态，不但可以造成蛋白质沉淀，也可以影响其生物活性。也可能影响蛋白质的稳定性。三、改变蛋白质的天然构象蛋白质的三维结构是由疏水相互作用、静电相互作用、氢键、范德华力这些弱相互作用力及二硫键所维持的。在分离提纯、使用、储存过程中,搅拌、升温、pH变化、盐浓度变化、添加表面活性剂或有机溶剂等因素对大部分蛋白质都有造成结构变化的可能。而目标蛋白质自身浓度的变化也有可能造成三维结构的变化,导致失活。失活的蛋白质就成为杂质,不仅无用,还可能有毒。蛋白质构象变化1，蛋白质浓度细胞中成千上万种生物分子以不同的浓度发挥着各自的生理作用，但是体外研究中常常忽略细胞内的拥挤环境。体外模拟反应都是在稀溶液中进行。而真实的细胞内是异常拥挤不堪的。细胞内含有大量的多糖、蛋白质、核酸等大分子物质，这些大分子以不同的浓度存在，细胞质内所有大分子的浓度估计高达80-200g/L，细胞容积的20%-30%都被大分子占用，细胞内是高度拥挤的大分子环境。

细菌细胞内拥挤环境图许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，某些酶蛋白溶液在37C放置的半衰期仅几个小时。这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。细胞内的拥挤环境限制了蛋白质相互反应过程中的构象变化。但是，在我们使用蛋白质（酶）时，蛋白质的浓度都是极稀的，一般在0.1mg-100mg/L，甚至更低。过低的蛋白质浓度使蛋白质的构象不断变化，导致生物活性下降。2，物理因素温度是影响蛋白质稳定性最重要的因素。细胞机械破碎、错流式膜过滤等操作必然有升温的问题，有可能造成蛋白质的热变性。一般而言,大多数蛋白质在0-4C

之间较稳定。而大多数的热变性都是不可逆的。一些蛋白质对溶液的冻融也很敏感。蛋白质的器壁吸附现象，这个现象几乎在蛋白质与固相表面接触的同时即会发生,最大量的吸附往往发生在蛋白质的等电点附近。吸附受到器壁表面性质、蛋白质性质及溶液条件的影响,其中最主要的影响因素是表面能量。大多数蛋白质与聚苯乙烯的吸附即是不可逆的。

3，化学因素（1）强酸和强碱，强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的pH，引起蛋白质表面必需基团的电离，由于各氨基酸残基所带电荷的相互吸引或排斥使蛋白质的空间结构发生较大变化，改变了原来蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象重新排布，导致不可逆失活。（2）有机溶剂，水互溶有机溶剂可以使酶、蛋白质失去活性，是因为有机溶剂取代了蛋白质表面的结合水，并通过疏水作用与蛋白质结合，改变了溶液的介电常数，从而影响维持蛋白质天然构象的非共价力的平衡。3，去污剂和表面活性剂；去污剂一般分为离子型和非离子型两大类，都具有长链疏水尾和亲水的极性头。当少量的阴离子去污剂（如十二烷基硫酸钠，SDS）单体加入到蛋白质溶液中时，去污剂与蛋白质表面的疏水区域结合。随着加入量增加，与蛋白质的结合位点达到饱和，这时去污剂则以协同方式结合于蛋白质其它位点，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露，并进一步与去污剂结合，直到达到饱和为止，从而使蛋白质发生不可逆变性。4，变性剂，如高浓度脲（8-10mol/L）和盐酸胍（6mol/L）常常用于蛋白质变性和复性研究，由于脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键，引起蛋白质不可逆失活。四、化学物质对蛋白质的稳定作用

蛋白质的稳定性是指蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活性的能力。根据生物体内蛋白质等存在的状态，可以利用化学物质或化学方法使蛋白质稳定化，以有利于蛋白质在体外的应用。通过研究蛋白质的变性及稳定性，可以了解蛋白质的结构功能与稳定性的关系等。在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可以通过化学方法使蛋白质稳定。其中常用的方法有以下几种：固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机载体、高分子载体）；添加剂：保护蛋白质（酶）不被氧化、不受变性剂变性等化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。稳定剂共溶剂

糖类，醇氨基酸及其衍生物无机盐，甘油，聚乙二醇等常用1-4M浓度共溶剂来稳定蛋白质和细胞器。抗氧化剂

底物、辅酶金属离子

化学交联剂半胱氨酸，2-巯基乙醇还原谷胱甘肽，二巯基赤藓醇等巯基试剂可防止巯基氧化植物抗氧化剂如儿茶酚黄酮等也具有保护作用酶可被底物辅酶、竞争性抑制剂及反应产物等所稳定。金属离子不仅可以影响酶的活性，还可以影响酶的稳定性如Ca2+多位点结合使得蛋白质分子成为紧密的活性形式。交联剂可在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或蛋白质与其他分子之间（如固定化载体）发生交联反应使蛋白质的构象稳定。五、化学物质的共价修饰作用

由于大多数亲水性氨基酸残基都分布在蛋白质表面，因此，一些活泼得到化学物质可以直接与蛋白质表面的活性基团发生反应，从而产生生理活性（包括药理、毒理等）。除少数烷化剂外，绝大多数外源化合物需经体内代谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再与细胞内蛋白质分子中的亲核基团反应。其中的一些特殊的化合物也被用于研究蛋白质的结构，以及蛋白质的标记（如荧光探针）等。

1，蛋白质分子中的可反应基团

蛋白质中可以发生反应的氨基酸残基主要有：N-末端的氨基，赖氨酸残基中的-氨基；半胱氨酸残基中的巯基，丝氨酸及苏氨酸残基中的羟基，酪氨酸残基中的酚羟基以及组氨酸残基中的咪唑基和色氨酸残基中的吲哚基。最容易发生反应的主要是氨基和巯基。试剂类型化合物或前体反应机制烷基化芳香基化卤代物亲核取代环氧化物硫酸烷基酯活泼的烯烃1,4-加成羰基化合物醛形成席佛碱酰基化有机酸酐、酰氯等亲核取代或加成磷酰化有机磷亲核取代自由基·OH、·CCl3自由基反应具有亲电氮化合物芳香胺亲核取代2.茚三酮反应

在酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热，生成紫色化合物Pro的茚三酮反应呈黄色Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。3,氨基的反应

二硝基氟苯（DNFB）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。3.氨基的反应

丹磺酰氯法③Edman氨基酸顺序分析法Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。此反应即是目前“蛋白质顺序测定”的设计原理④氨基的含量测定有许多化合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺酸(TNBS)就是其中非常有效的一种。TNBS与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。在蛋白质序列分析中，用于多肽链N-末端残基的测定的化合修饰方法--2，4-二硝基氟苯(DNFD)法、丹磺酰氯(DNS)法和)苯异硫氰酸酯(PITC)法都是常用的氨基修饰方法。

4，巯基的反应分子氧、H2O2以及过氧化物（如过氧甲酸）、氧自由基等是最常见的氧化剂，在生物体内，蛋白质的氧化失活主要是通过活性氧（羟基自由基、超氧离子、过氧化氢、过氧化物）来完成的。这些氧化剂的杀菌作用主要也是造成蛋白质失活。各种氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。在碱性条件下，半胱氨酸可以被Cu2+氧化成次磺酸或亚磺酸或磺酸半胱氨酸。巯基的化学修饰

5,5'-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)，又称为Ellman试剂，目前已成为最常用的巯基修饰试剂。DTNB可以与巯基反应形成二硫键，产生的5-巯基-2-硝基苯甲酸阴离子在412nm具有很强的吸收，可以很容易通过光吸收的变化来监测反应的程度。有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，该化合物溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时在255n