dnaran琼脂糖凝胶电泳课件

核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳

目录核酸组成理化性质核酸分离、纯化的原则核酸提取的基本步骤材料准备细胞裂解分离、纯化沉淀溶解DNA提取的常用方法RNA提取的常用方法核酸的保存琼脂糖凝胶电泳

核酸DNARNAGenomicDNA(原核、真核、病毒)细胞器DNA(叶绿体、线粒体等)质粒DNA(细菌、放线菌等)mRNA(1%-5%)rRNA(80%-85%)tRNA(小分子RNA)(15%-20%)核酸(nucleicacid)核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。核酸分离、纯化原则1、保持核酸分子一级结构的完整性温度不要太高控制pH值范围(pH值5-9)

保持一定离子强度减少物理因素对核酸的机械剪切力核酸分离、纯化原则核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂2、防止核酸的生物降解DNA酶抑制剂金属离子螯合剂：

DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。阴离于型表面活性剂

SDS除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物有核酸酶抑制剂作用。1：手指头

2：枪头

3：水/缓冲液

4：实验台面

5：内源Rnase6：RNA样品

7：质粒抽提

8：RNA保存

9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶Rnase污染的10大来源DNA提取的基本步骤I.材料准备II.裂解III.分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸V.溶解材料准备使用新鲜材料，样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；蛋白酶处理核酸分离、纯化

多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。核酸沉淀、溶解重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。核酸的保存(1)对DNA

①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA

①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;DNA提取的常用方法基因组DNA的提取SDS法其它原理基因组DNA－SDS法SDS在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。吸附材料结合法：根据核酸分离纯化方式的不同有：高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。其他方法硅质材料阴离子交换树脂磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁珠硅质材料高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。硅质材料低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。硅质材料阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。磁珠Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA的完整性。TRIZOL法提RNA问题一：DNA降解材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老提取操作过于剧烈，DNA被打断外源核酸酶污染低温保存，避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后操作应尽量轻柔试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融核酸提取常见的问题问题二：DNA样品不纯DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）RNA提取常见问题二：得率低

样品太多或太少RNA在柱子上未洗出洗出液中有酒精减少或增加样品使用量加入RNaseFree,放置几分钟再离心漂洗后再次离心RNA提取常见问题三：降解

样品不新鲜或保存不当RNase污染RNA溶液储存不当取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存研磨样品及时补充液氮严格处理相应的器具和试剂-70℃冻存，分装使用

为了检测提取核酸的浓度和内参，需要继续做琼脂糖凝胶电泳实验实验原理（1）DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。

（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶缓冲液（1）制备凝胶和胶板：

100ml(1×TBE)+1g琼脂糖（三角瓶），煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子。（2

）加样：

5μl质粒DNA+1μlloadingbuffer，混匀

5μlPCR产物+1μlloadingbuffer，混匀（3）电泳：电压80-120V，注意电极方向15min（4）观察：紫外透射分析仪下观察。电泳常见问题分析DNA降解：避免核酸酶污染。电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

DNA变性：电泳前勿加热，可以在电泳仪上面放冰袋，避免温度高变性条带浅，Marker弥散了---那要么就是胶的问题，要不就是buffer的问题。化胶的时候一定要化匀，buffer尽量用新鲜的

实验室跑一般都是120V,最多跑到150VDNA电