微孔板检测技术的原理和应用

微孔板检测技术的原理和应用第一页，共一百一十七页，2022年，8月28日原理及应用介绍大纲光的物理简介光吸收检测的原理与应用实例荧光检测的原理与应用实例发光检测的原理与应用实例第二页，共一百一十七页，2022年，8月28日光的物理简介光的本质光的性质第三页，共一百一十七页，2022年，8月28日光的本质一种能量电磁波电子能级（轨道）波粒二相性衍射光电效应红外线第四页，共一百一十七页，2022年，8月28日光的性质基本性质速度：3×108m/s波长：颜色频率：能量E=hν其他性质偏振荧光：激发c=λ×ν第五页，共一百一十七页，2022年，8月28日光的性质物体的颜色白光是复合光单色光互补色光溶液的颜色由溶液中的质点（分子，离子）吸收特定波长的光，透射其互补色的光吸收曲线KMnO4溶液的吸收曲线(cKMnO4:a<b<c<d)第六页，共一百一十七页，2022年，8月28日原理及应用介绍大纲光的物理简介光吸收检测的原理与应用实例荧光检测的原理与应用实例发光检测的原理与应用实例第七页，共一百一十七页，2022年，8月28日光吸收检测的原理当光穿过待测物时，光的强度（能量）发生变化bcIIAbsorbance××lg0e==

（公式反应了与浓度的依赖关系） I0

入射光强度 I 透射光强度

摩尔消光系数

b 光程 c 样品浓度II0第八页，共一百一十七页，2022年，8月28日吸光值(Absorbance)的意义Absorbance(OpticalDensity):%ofLightTransmitted:%ofLightAbsorbed:0OD100%0%1OD2OD3OD4OD5OD6OD7OD8OD

1%0.1%0.01%0.001%0.0001%0.00001%0.000001%90%99%99.9%99.99%99.999%99.9999%99.99999%99.999999%10%第九页，共一百一十七页，2022年，8月28日影响结果的因素单色光不纯非平行入射光介质不均匀溶液浓度过高溶液中发生化学反应第十页，共一百一十七页，2022年，8月28日光吸收的应用如果光的强度变化能够反映被测量物的待测性质，则显色反应都可以使用光吸收核酸和蛋白质的紫外光吸收检测酶联免疫检测（ELISA）酶动力学分析细菌内毒素检测乙酰胆碱脂酶检测细胞活性检测（MTT）环境监测第十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日核酸的紫外光吸收检测DNA，RNA的吸收峰在260nm标准曲线法光程测量法（光程未知【酶标板】）校正吸收值到1cm光程通过水（如果溶剂是水）的1cm光程吸收值来校正第十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日标准曲线法作光吸收最常用的方法已知浓度样品吸收值（同一光程【比色杯】）标准曲线未知吸收值带入，得到未知样品浓度第十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日光程测量法光程不一致时（酶标板）通过水的吸收值（1cm光程）来求得实际光程水在977nm有吸收峰，在900nm几乎无吸收（与溶质的吸收峰无重叠）Pathlength：实际的光程A977：水溶液样品在977nm的吸光值A900：水溶液样品本底Awatercm-1：1cm光程比色杯中水的吸光度值（A977）－本底值（A900）第十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日光程测量法水相样品的吸收值/cm光程：光程的校正水：998nm等消光点（受温度影响小）977nm吸收峰Asample：样品在特定波长的吸光值

第十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日实例：DNA浓度的测量水的吸光度/cm

Result: Awater:A998–A900:0.159OD/cm样品的吸光度 A998–A900:0.132OD

A260:0.084OD第十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日实例：DNA浓度的测量光程的校正DNA的分光光度计标准，1OD/cm

相当于50ng/ulDNA相当于40ng/ulRNA相当于33ng/ulOligo结果计算：0.101×50ng/ul=5.05ng/ul第十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日实例：蛋白定量CoomassieBrilliantBlueG-250加入蛋白质酸性环境下呈茶色与蛋白质结合变蓝色

CBG是一种指示剂470nm595nm第十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日实例：ELISA抗原，抗体，底物，显色反应阴性域值，阳性程度，定量第十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日实例：细胞活性检测（MTT）细胞代谢活动与活细胞数直接成比例（线粒体的活性脱氢酶的活性）MTT：一种甲氮唑盐，是细胞线粒体脱氢酶的底物；活细胞内的线粒体脱氢酶可将MTT分解产生蓝黑色（fromazan）产物进入活细胞，被分解，裂解细胞，分析吸光度Fromazan吸光谱第二十页，共一百一十七页，2022年，8月28日实例：细胞活性检测（MTT）第二十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日实例：内毒素检测（LPS）LPS：存在于革兰阴性(G－)细菌细胞壁外层，脂多糖，为细菌类属的共同抗原，介导多种生物效应。可作为多种与G－细菌相关疾病的诊断和预后指标方法：鲎血细胞基质染色试验原理：LPS作用于鲎血细胞溶解物中的凝固酶原使之成为凝固酶。凝固酶水解人工底物显色。（检测波长：405nm）第二十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日实例：乙酰胆碱脂酶检测乙酰胆碱酯酶（AChE）：可作为反映胎儿神经系统成熟度的指标。方法：乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可以与巯基显色剂反应生成TNB黄色化合物。（检测波长：450nm）第二十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日光吸收的优势和缺点优势技术成熟设备和试剂成本低操作简单第二十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日光吸收的优势和缺点缺点动态范围窄灵敏度低（核酸到ng级）特异性不强受溶液的浓度和粘稠度影响细胞学实验中采用的吸收底物往往有细胞毒性相互作用检测很难实现实时检测无法做多标记检测第二十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日原理及应用介绍大纲光的物理简介光吸收检测的原理与应用实例荧光检测的原理与应用实例发光检测的原理与应用实例第二十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光原理荧光：某些物质吸收特定波长的光能量（能量高），从基态(S0)成为激发态(S1)；被激发的分子通过内部转化失去能量并回到基态；同时发出波长更长的光（能量低）第二十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光原理Excitationinfemtoseconds(10E-15seconds)Internalinpicoseconds(10E-12seconds).Emissionintherelativelylongtimeperiodofnanoseconds(10E-9seconds)Tremendouslysensitiveemissionprofiles,spatialresolution,andhighspecificityoffluorescenceinvestigations,thetechniqueisrapidlybecominganimportanttoolingeneticsandcellbiology.第二十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光的优势灵敏度高——可以低到单个分子对环境敏感细胞毒性较小，可以进行活细胞或活体检测实时检测多标记检测（如蓝色细胞核，红色线粒体等等）检测模式多样，具有多种类型的荧光探针和荧光染料兼容性强——可以兼容多种仪器平台和多种样本形式使用方便，高效安全，无辐射第二十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日以荧光为基础的检测技术荧光强度(FI)时间分辨荧光(TRF)荧光偏振(FP)荧光共振能量转移(FRET)均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)荧光寿命(FLT)第三十页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光强度（FI）DNA、RNA的荧光定量荧光ELISA酶动力学分析药物代谢（CYP450）氧化酶的呼吸爆发细胞凋亡研究细胞基础实验（细胞吸附、细胞渗透、细胞迁移、细胞增殖、细胞毒理研究等）钙流检测报告基因检测（GFP）第三十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日DNA的荧光定量Figure2λ-DNAmeasuredwithPicoGreen（485/535nm）Figure1λ-DNAmeasuredwithabsorbanceat260nm灵敏度比较：260nm光吸收：50－250ng/mlPicoGreenFluorescence：300pg/ml第三十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日细胞贴壁研究细胞的贴壁性反映了细胞的状态，类型传统方法：细胞计数，繁琐不准确荧光强度方法荧光标记细胞微孔板孵育洗去未粘附细胞检测板底荧光强度第三十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日死细胞数目检测药物的毒性；外界刺激细胞受损死亡细胞的膜破裂PI（PropidiumIodide），一种膜不渗透性DNA荧光染料PI的荧光强度反映了死细胞数目PIPIPIPIPIPIPIPIPIPIPIPIPI活细胞

死细胞或受损细胞第三十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日细胞凋亡分析某些细胞凋亡的信号通路包括Caspase3的酶活性提高模拟Caspase3底物Z-DEVD-R110NonfluorescentCaspase3Caspase3Rhodamine110FluorescentCaspase在细胞凋亡中起着中心作用第三十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日酶活性分析药物代谢酶活性分析细胞色素P450酶家族成员负责大约20％普通药物代谢P450酶活性的调节P450的抑制物的筛选第三十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日酶活性分析底物构造荧光染料＋封闭基团＝不发荧光加入酶促反应之后，底物被切开，荧光染料与封闭基团分离加入候选药物分子，可筛选作用于药物代谢通路的调解物e.g.CYP3A4DrugcandidatesX第三十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日酶活性分析加入不同浓度的底物的CYP的反应曲线CYP抑制剂筛选第三十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日紫外荧光利用蛋白内部发色团（Tryptophan、Tyrosine、Phenylalanine）作为荧光指示剂（紫外激发），可分别对蛋白结构,构象,亚基组装，酶与底物结合，蛋白结构的共效应因子进行研究。发色团的暴露或掩藏还可以研究一些电子传递链的耦连剂NADHFADB族维生素，维生素A，E检测第三十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日紫外荧光－蛋白质的折叠/变性RNaseA的热变性曲线第四十页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光强度应用的不足部分荧光素激发峰与发射峰往往相隔很近，干扰检测发射光产生极快，且持续时间短，容易与激发光重叠，干扰检测第四十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日时间分辨荧光（TRF）以镧系元素(稀土离子：铕、钐、镝、铽）为标记发射功率低，螯合Europiumion第四十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日时间分辨荧光（TRF）激发波长与发射波长差距大（>200nm）光谱窄发光时间长ElapsedTimeIntensity

ExcitationAutoFluorescenceFluoresceinEmission

EuropiumEmission较长延迟时间------Measurement------Eu:激发波长320nm，发射波长612/620nm第四十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日时间分辨荧光（TRF）和普通荧光相比，排除了背景光干扰所有普通荧光强度（FI）检测，如干扰影响极大，无法排除，均可采用时间分辨荧光标记来解决第四十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日以荧光为基础的检测技术荧光强度(FI)时间分辨荧光(TRF)荧光偏振(FP)荧光共振能量转移(FRET)均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)荧光寿命(FLT)第四十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日用FI的方法检测分子间结合缺点：1、步骤繁琐，需要洗涤2、且每次洗涤强度很难一致，造成结果有差异，重复性差。优点：1、步骤简单，无需洗涤2、试验均一性，重复性好非均相试验孵育(结合)洗涤（去除非结合）

检测均相试验孵育(结合)检测第四十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光偏振（FP）的原理光的偏振性PolarizerAnalyzerAnalyzerPolarizer第四十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光偏振（FP）的原理如果荧光基团在处于激发态的时间内（如Fluorescein为4ns)保持静止，那么它发射出的荧光也是与激发光是同平面的polarizedexcitation100%0%stationaryfluorophore第四十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光偏振（FP）的原理如果荧光基团在处于激发态的时间内是运动状态，那么它发射出的荧光会发生偏振平面的改变polarizedexcitation<100%>0%fluorophoreinmotion第四十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光偏振（FP）的原理荧光偏振改变反映了分子的运动状态，也可以说反映了分子所处的环境的状态分子运动快，偏振方向改变大分子运动慢，偏振方向改变小荧光偏振：分子运动越快，P值越小分子运动越慢，P值越大第五十页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光偏振（FP）的原理分子体积与运动速度的关系体积越大，运动速度越慢体积越小，运动速度越快分子所处环境与运动速度的关系溶液的粘稠度利用荧光偏振的特性可以研究相互作用分子结合，体积改变，运动速度变化，P值相应发生变化溶液状态变化，溶液的粘稠度改变，其中的分子运动速度变化，P值相应发生变化第五十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光偏振（FP）研究分子相互作用原则荧光基团标记在小分子上，偏振值低当小分子与较大的分子结合后体积增加，偏振值增加偏振值的大小反映了两个分子之间的结合效率与结合数量第五十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光偏振（FP）研究分子相互作用配体受体结合

蛋白质与蛋白质结合抗原抗体结合蛋白质与DNA的相互作用

DNA杂交酶活性检测膜的流动性分析第五十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日Estradiol与EstradiolReceptorER：能和小分子疏水配体结合的核受体超家族成员，穿梭于胞浆和胞核内，具有转录因子的作用（DNA结合），包括ERα、ERβ两种亚型Estradiol（雌激素）：与ER结合，引起其入核，调节基因转录Estradiol类似物第五十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日ER-β竞争性结合物的筛选雌激素受体ER-β竞争性结合物可作为候选的药物成分具体步骤荧光标记的雌激素ES2与ER-β结合，复合物较大，P值较大加入竞争物之后，则能够将ES2替换下来，单独的ES2体积小，P值减小P值的减小程度与竞争物的浓度的关系反映了竞争物的竞争性第五十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日ER-β竞争性结合物的筛选第五十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日Estradiol-ER与DNA结合ER核受体，Estradiol与DNA结合，调节基因转录传统方法EMSA放射性，繁琐第五十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日Estradiol-ER与DNA结合荧光偏振方法亲和层析纯化ERFAM标记的DNA结合序列偏振分析第五十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日激酶活性分析竞争性免疫分析检测激酶活性被激酶磷酸化的产物与荧光标记的磷酸化示踪物竞争磷酸化抗体荧光标记的磷酸化示踪物与抗体结合后荧光偏振值增加激酶活性决定了磷酸化产物比例，荧光偏振值增加的程度与激酶活性成反比例抑制物对激酶活性的影响第五十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日激酶活性分析第六十页，共一百一十七页，2022年，8月28日蛋白酶活性分析蛋白酶将大分子的蛋白切割成小的片断，荧光偏振值变小研究蛋白酶的动力学参数peptidefragmentsProteaseProtein第六十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日偏振中数据处理问题G值仪器分别测量与激发光偏振平面平行和垂直的偏振光时，使用相同但是不是同一个光学元件校准，使用已知偏振值的荧光物质及其相应的缓冲液计算G值。P实际＝G×P测量G＝((RFU－BUF)×(1＋Pref))/((RFU－BUF)×(1＋Pref))第六十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日偏振中数据处理问题只有当被测样品的信号变化比对照组（正μC+、负μC-）有足够的标准偏差，结果才有意义。第六十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日偏振中数据处理问题第六十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光偏振优势均相(无分离/洗涤）在溶液中进行，没有固相的参与，因此反应速度较快，操作也相应简单测量的是比值，结果与荧光基团的绝对浓度/强度无关无破坏性(可重复测量)无放射性可实现高通量第六十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光偏振缺点FP使用具有较短寿命的荧光素（如Fluorescein,TAMRA)，它被限定为：荧光标记的小的配体（如抗原）和大的受体（如抗体）的结合。检测依赖于分子结合造成的分子体积的显著改变。第六十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日以荧光为基础的检测技术荧光强度(FI)时间分辨荧光(TRF)荧光偏振(FP)荧光共振能量转移(FRET)均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)荧光寿命(FLT)第六十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光共振能量转移（FRET）FRET：一对合适的荧光物质，前者的发射波长正好是后者的激发波长，当二者达到一定的分子距离时（1～9nm），供体发出的光子能量会传递给受体分子，受体被激发，发射荧光供受体的激发光谱要分得足够开供体的发射光谱要与受体的激发光谱重叠供受体的发射光谱要分得足够开第六十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光共振能量转移（FRET）荧光能量传递的效率与分子间的作用距离相关因此能量传递的发生及强度可以作为分子间发生相互作用以及相互作用强弱的指示特征第六十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日FRET的应用分子间相互作用药筛模型蛋白质与核酸的结构和构象研究/蛋白质复合物的分配与组装测量DNA寡聚体的结合（溶液中DNA杂交的动力学测量）膜融合研究分子内和分子间的距离测量标记的大分子上特定位点的距离测定供体和受体的距离，受体/配基相互作用第七十页，共一百一十七页，2022年，8月28日激酶反应检测FRET荧光素对标记底物分子位点特异性的酶不能切开被激酶磷酸化的底物，保持FRET；磷酸化的底物失去FRET测量Donor的发射光（445nm）和Acceptor的发射光（520nm），计算比值445/520。比值越大，激酶活性越强第七十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日FRET的优势均相检测(无分离和洗涤步骤)在溶液中进行，没有固相的参与，因此反应速度较快，操作也相应简单可以很好地观察活细胞内酶活性变化，并且能做到定时、定量、定位，是一种非常有效的研究手段无放射性第七十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日FRET的缺点供体与受体的距离限定为10-80Å，而许多生物结构（如蛋白-DNA复合物，大的蛋白，膜等）为80-130Å信噪比经常不佳，通常为1：1；背景噪声来自供体荧光干扰及受体被直接激发供体与受体浓度的比率很关键必须有两种荧光标记第七十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日以荧光为基础的检测技术荧光强度(FI)时间分辨荧光(TRF)荧光偏振(FP)荧光共振能量转移(FRET)均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)荧光寿命(FLT)第七十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)结合TRF与FRET，选择发光时间长的稀土元素作为Donor，使得Acceptor的发光时间更长选择检测时间，避开激发光和Acceptor直接被激发的发光时间区域解决信噪比问题第七十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日应用实例：cAMP浓度检测cAMP重要的第二信使传统的报告基因方法HTRF供体: 抗cAMP抗体用铕螯合物Eu(K)标记受体: cAMP用XL665(Allophycocyanin)标记样品分子: 处理后的细胞裂解物cAMP与标记的cAMP竞争结合抗体计算受体发射光与供体发射光的比值，比值越大则细胞中cAMP的浓度越低第七十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日应用实例：cAMP浓度检测YenergytransferXL665EuExcitationat320nmEmissionat665nmlong-liveddecayat665nmTimeIntensitycAMP由于Eu元素的荧光寿命较长，当FRET效应存在时，会使得XL665也保持较长的能量衰减时间EnergyTransferfromEutoXL665第七十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日应用实例：cAMP浓度检测cAMPExcitationat320nmEmissionat665nmshort-livedsignalat665nm,discriminatedbytimingparametersTimeIntensityXL665如果不存在FRET效应，激发光直接激发APC，APC所发出的是一个短寿命的荧光NoEnergyTransfer第七十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日应用实例：cAMP浓度检测YEuExcitationat320nmEmissionat612/620nmlong-livedsignalat612/

620nm,discriminatedbywavelengthTimeIntensityNoEnergyTransfer对于部分没有结合的Eu标记的抗体分子，同样会被激发出长寿命的荧光第七十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日均相时间分辨荧光的优势镧系元素标记，能量传递效率更高，放大了所能检测到的作用距离范围(100-200Å)，提高了检测的灵敏度及应用范围时间分辨的检测方法，可极大地降低背景荧光的干扰，提高信噪比均相，操作简单快速，仅需三个步骤:加样，孵育，测量采用比率计算，更为准确，降低了系统误差第八十页，共一百一十七页，2022年，8月28日以荧光为基础的检测技术荧光强度(FI)时间分辨荧光(TRF)荧光偏振(FP)荧光共振能量转移(FRET)均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)荧光寿命(FLT)第八十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光寿命（FLT）荧光寿命τ：荧光分子在回到基态之前之前维持激发态的平均时间一般在ns范围内荧光寿命受到许多条件的影响，可作为一种分子状态（环境）改变的标志检测速度是其他方法的几百万倍对分子进行动态监测，时间显微技术第八十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光寿命（FLT）I(t)=I0e(-t/t)

荧光寿命：当荧光强度衰减到最高值的1/e时（一般是37%)所经过的时间外界环境和分子自身的状态变化影响荧光寿命τ=1/(krad+knonrad)第八十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日使用FLT筛选药物快速，高通量筛选人类α凝血酶抑制子已知aptamer是一种有效的抑制因子用IRIS-5标记aptamer，与α凝血酶结合或分离表现不同的荧光寿命代筛选的物质与aptamer竞争α凝血酶导致aptamer的分离改变荧光寿命第八十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日使用FLT筛选药物筛选窗口FP验证第八十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光技术总结FI，TRF相对而言是一项异相操作技术，相比均相检测技术较为烦琐，但应用范围更广，操作灵活FP、FRET、HTRF均是均相分子检测技术，摈弃了异相操作的烦琐步骤、洗涤条件的严格控制、结果的不均一化等条件的限制FP技术整体操作简单易行，所耗试剂成本较低，而且可以进行动力学计算，但容易受一些外界因素影响（背景干扰，溶液离子环境）、检测范围相比而言较窄（分子量的限制）FRET技术相比FP而言可进行活体检测，是一项动态分析检测技术，可以计算分子间相互作用的平衡常数以及反应速率。但试剂成本较高，而且容易受直接激发干扰，分子间的检测距离也往往受到一定的限制。第八十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日荧光技术总结HTRF技术能解决分子间检测距离的限制，也基本不受溶液离子环境，温度、背景荧光，激发光等的干扰，且能排除加样体积等的影响HTRF采用的是比率计算，从而消除了分子浓度不均一等造成的系统误差。因此相比而言，HTRF是一项信噪比绝佳的荧光分析技术。而且HTRF还是一项动态分析检测技术FLT是一项新技术，以其检测敏感，时间短和高通量为优势，但是对仪器配置要求很高第八十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日原理及应用介绍大纲光的物理简介光吸收检测的原理与应用实例荧光检测的原理与应用实例发光检测的原理与应用实例第八十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日发光原理发光：与荧光类似，同样是由于电子的跃迁产生的，但促成电子的跃迁的能量不是由光源直接激发造成的，而是来源于反应中产生的能量化学发光是能量来自于化学反应引起的发光生物发光是能量来自于酶促催化下的生化反应引起的发光分类连续发光型（辉光型）：发光长效持久，无需自动加样器。(eg.Alkalinephosphatase)瞬时发光型（闪光型）：发光时间短，变化快，需使用自动加样器。(eg.Aequorin)第八十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日发光原理Intensitytime20minutes1.5-2hoursFlashlumiassay:PicaGene–singlecolorGlowlumiassay:PicaGeneLT(longlifetime)第九十页，共一百一十七页，2022年，8月28日发光的应用领域报告基因检测化学发光免疫分析核酸定量(PCRQuantification)酶活分析活性氧分析BRET分析第九十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日报告基因检测评价启动子调控效率和其中作用元件的有效方法双报告系统同时向细胞中转入两种报告基因其中一种为待研究的启动子控制（荧火虫荧光素酶），另一种为不被处理所影响的启动子控制（海肾荧光素酶）作为内参消除系统误差第九十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日报告基因检测Transfectcells分别将两个载体中的SV40启动子替换成一个目标启动子和一个内参启动子分别测量两个报告系统中luciferase表达量将结果用内参均一化（比值）第九十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日报告基因检测得出报告基因活性在不同条件下的相对值第九十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日报告基因检测的优势减小随机误差比率计算避免了系统误差超高的灵敏度（极低的背景干扰）动力学范围更广发光强度在4～6个数量级之间与测定物质浓度间呈线性关系无需昂贵的设备投入手段更为灵活第九十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日生物发光共振能量传递（BRET）研究分子间相互作用EnergytransferfrombioluminescentDonor

fluorescentAcceoptorDonor=Renillaluciferase(Rluc)Acceptor=GreenFluorescentProtein(GFP²)第九十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日生物发光共振能量传递（BRET） 加入底物DeepBlueCTM，Rluc发射蓝光(390-400nm)，当A蛋白和B蛋白结合，生物共振能量传递发生，GFP发射绿光(505-508nm)RlucDeepBlueC™GFP²ProteinAProteinBDeepBlueC™RlucGFP²BRET²第九十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日BRET的应用领域蛋白组学监测蛋白-蛋白相互作用检测胞内细胞器间的相互作用在哺乳动物细胞中对酵母双杂交结果的验证受体研究细胞信号传导通路研究第九十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日BRET的优势与缺点优势避免了光漂白信号稳定：可维持1小时分析方法灵活缺点步骤繁琐，难度高在细胞中要同时表达两种蛋白融合蛋白第九十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日总结第一百页，共一百一十七页，2022年，8月28日各种技术的影响因素第一百零一页，共一百一十七页，2022年，8月28日GeniosPro检测模式及仪器特点主要竞争产品分析第一百零二页，共一百一十七页，2022年，8月28日GeniosPro之检测模式及仪器特点检测模式应有尽有－堪称全能战士：光吸收（230－1000nm）荧光强度（230－900nm）荧光偏振(275–750nm)时间分辨荧光均相时间分辨荧光底部阅读荧光共振能量转移FRET化学发光：连续和瞬时化学发光共振能量转移BRET双报告系统：Chroma-Glo

第一百零三页，共一百一十七页，2022年，8月28日GeniosPro之检测模式及仪器特点仪器设计独到巧妙－－堪称滤光片系统的精致之作每一个细节都体现着精致：光源：高能闪烁氙灯——检测范围更广，从紫外区到远红外区使用寿命更长（可闪烁1百万次以上）无需预热，工作状态更稳定适合瞬时检测

第一百零四页，共一百一十七页，2022年，8月28日GeniosPro之检测模式及仪器特点每一个细节都体现着精致：光路：

发光、顶部和底部阅读各自采用独立的光路系统，避免了相互干扰无光纤，内置多个二分镜，由二分镜分光，最大限度的减少了光传播途径中的能量损失。

第一百零五页，共一百一十七页，2022年，8月28日GeniosPro之检测模式及仪器特点每一个细节都体现着精致：检测器：光吸收、荧光和化学发光检测分别由三个各自独立优化的检测器完成：

光电二极管：检测范围广，满足4O.D以下的吸收光检测

低暗电流PMT：具有大光敏面积，适用于各类荧光检测

单光子计数PMT：用于化学发光及BRET的检测，具有增益值高、暗电流小、噪声低、时间分辨率高、量子效率高、红光敏感等特点。

（其他产家产品多数只有两个探测器，一个针对光吸收，一个针对荧光，兼顾较强的化学发光）

第一百零六页，共一百一十七页，2022年，8月28日GeniosPro之检测模式及仪器特点每一个细节都体现着精致：滤光片——滤光片分组放入条形架中，可随意插入，取出，既保护了滤光片