第四章卫生微生物研究和检测的

第三章环境中微生物的

主要类群原核细胞型微生物真核细胞型微生物非细胞型微生物原核细胞型微生物细菌（致病菌、条件致病菌，非致病菌）放线菌鞘细菌滑动细菌蓝细菌真核细胞型微生物真菌藻类原生动物真菌酵母菌霉菌第四章卫生微生物研究和检测的方法卫生微生物检测的特点和基本原则卫生指示微生物卫生微生物研究和检测的方法第一节

卫生微生物检测的特点与基本原则特点：检测对象：致病、非致病、条件致病微生物标本来源：人体、环境环境中致病微生物数量少，需要特异的检测方法，并且多依靠指示微生物原则：样品的采集原则样品的运送原则实验室检验原则一、样品的采集原则（一）样品必须要有代表性:采样量：满足检测要求采样部位：均匀采样采样时间：便于分析微生物的动态变化采样批号：尽量检测每个批号（二）避免对样品的污染器材灭菌、无菌操作（三）避免对样品中微生物的杀灭和抑制避免有毒物质的残留和高温影响（四）对样品进行详细的标记这是基本要求肉类生肉：取屠宰后两腿内侧肌或背最长肌100g/只熟肉：酱卤制品，熏肉及灌肠取样应不少于200g，烧烤制品应取样50cm2熟禽：每份样品1只肉松：每份样品200g香肚：每份样品1个要在容器的不同部位采取清凉饮料形成批次的产品数试样数量8000个以下2个8000个以上，22000个以下3个22000个以上5个盒装鱼肉火腿、灌肠形成批次的产品数试样数量500个以下2个501个以上，800个以下3个801个以上，1300个以下5个1301个以上，3200个以下7个…….……二、样品的运送原则尽快送检：一般3-4h内送检，减少细菌死亡和进一步繁殖带来的影响。注意保护待检的微生物：一定的温度加保护剂运送培养基，如病毒、厌氧菌等根据生物安全规定，妥善包装待运输的标本进行完善的样品交接必须有样品送检单，与实验室人员逐项核对后交接三、实验室检验原则具有相应的实验室硬件设施：1级（P4实验室）：可检验危害性最严重的病原体，如天花病毒、HIV、SARS病毒等。2级（P3实验室）：可检验特殊危险致病菌，如霍乱菌。3级（P2实验室）：检验一般致病菌。4级（P1实验室）：检验非致病菌。具有合格的人员和标准检验方法人员要有资质，并经常接受培训采用国家标准方法或公认方法（WHO、EPA等）加强实验室质量控制仪器、设备、试剂：定期检定和校准注意记录和核查：如GLP实验室报告规范：数据规范，完整签名盖章实验室应有应急措施应对突发事件能力需做多种检验时，微生物优先恰当的样品处理与检验卫生微生物检测的基本原则第二节

卫生检验中的指示微生物指示微生物（indicatormicroorganism）定义：在常规卫生监测中，用以反映检品卫生状况及安全性的指示性微生物。设定指示微生物的原因微生物（包括致病和非致病的）种类繁多，不可能一一检测环境中致病微生物往往数量少，检测困难，需要用相对易于检测的微生物来间接反映一、指示微生物的选择总的原则：检测简便，相关性好粪便污染指示菌的选择检测简便：（易检出，易定量计数。）相关性好：（与粪便污染的相关性好。

与肠道致病菌的相关性好。）指示微生物的种类：反映微生物综合污染：细菌、霉菌和酵母菌落总数反映微生物污染来源：粪便污染指示菌（大肠菌群、粪大肠菌群）;空气污染指示菌（溶血性链球菌等）不得检出的致病微生物间接反映致病微生物：如反映肠道病毒的噬菌体等消毒效果指示菌：嗜热脂肪芽孢杆菌（压力蒸汽灭菌）；短小芽孢杆菌（电离辐射灭菌）；枯草杆菌黑色变种芽孢（环氧乙烷灭菌）二、常用的指示微生物（一）菌落总数1、菌落总数的概念和种类概念：单位量的被检样品(g、ml、cm2、m3)内，所含有的能在某种培养基上经一定条件培养后生成的菌落数量。种类：细菌菌落总数（不能说细菌总数）、霉菌和酵母菌菌落总数。报告：cfu/每单位样品量，如：cfu/g、cfu/ml。(cfu，colonyformingunit)2、菌落总数的卫生意义菌落总数是判定检样被微生物污染程度的指示菌，是某些样品的卫生限量标准。3、菌落总数的测定方法类型标准平板计数法、表面涂布法（二）粪便污染指示菌1．大肠菌群(coliformgroup)概念：大肠菌群系指一群能在37℃、24h内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。种类：总大肠菌群、耐热大肠菌群（粪大肠菌群）大肠菌群的卫生学意义：是常规检测的卫生指示菌，饮用水、生活用水、各类产品（食品、药品、化妆品等）都要进行检测，推断检样中有无被肠道致病菌污染的可能。测定方法：多管发酵法、滤膜法、纸片法。大肠菌群检测：35~37℃生长：培养于这个温度下24h内发酵乳糖产酸产气：培养基中加乳糖，24小时内观察是否产酸产气需氧或兼性厌氧：一般孵箱可革兰阴性无芽孢杆菌：革兰染色，光镜下观察。气：培养基中有气泡酸：培养基中加酸碱指示剂其他粪便污染指示菌

名称优点缺点指示作用应用大肠杆菌指示作用优于大肠菌群检测方法复杂人、畜粪便污染较少粪链球菌对不良环境抵抗力强，水体中繁殖低人粪便中数量少B>4.1，人粪污染；<0.7，动物粪污染；之间，混合污染必要时，辅助检测产气荚摸梭菌对不良环境抵抗力强数量多而大肠菌群少时，陈旧粪便污染水、土壤卫生指标菌注：B为粪大肠菌群与粪链球菌的比值三、其他指示微生物

1、不得检出的致病菌微生物主要危害主要指示作用沙门菌肠道致病菌口服药、食品不得检出志贺菌菌痢食品不得检出金葡菌局部化脓、食物中毒食品、化妆品、外用药不得检出；游泳池水指标菌溶血性链球菌乙型，食物中毒室内空气、食品指标菌铜绿假单胞菌条件致病菌外伤、眼科用药、化妆品不得检出，游泳池水指标菌破伤风梭菌外伤皮肤感染外用药不得检出2、肠道病毒指示微生物指示物优点缺点应用大肠杆菌噬菌体f2与肠道病毒耐受性似；存在于人粪中；检测较简便粪便中数量少；可能在环境中繁殖；检测结果受大肠杆菌DNA噬菌体影响水中病毒消毒效果评价指标脊髓灰质炎病毒减毒疫苗株І操作安全非所有粪便有；检测困难应用于消毒学和水中病毒研究第三节卫生微生物研究和检测的方法目标：检测环境微生物的种类、数量。样品的处理损伤菌的复苏选择性增菌与分离定量计数方法混匀样品（非常重要）液体：电动混匀、手摇混匀、敲打混匀固体：搅碎混匀、研磨混匀、匀浆混匀样品浓缩（提高检出率）沉淀法过滤法吸附沉淀法一、样品的处理（1）沉淀法：细菌可通过普通离心机离心沉淀而浓缩，或者通过差速离心，去除杂质，收集菌体，达到浓缩的目的。病毒浓缩需采用高速或超速离心机。（2）过滤法：是将样品在负压或正压作用下，通过孔径为0.45μm的滤膜，细菌被阻留在膜上，而达到浓缩的目的。样品中的病毒可通过膜的静电吸附浓缩。过滤法不但可浓缩微生物，还可消除样品中的抑制剂对后续培养的影响。二、损伤菌的复苏较低的培养温度无选择压力的培养环境三、选择性增菌与分离检品中的微生物有哪些？检测的困难：微生物小、少、是混合的。方法：让微生物繁殖，一个变成一大群，再把每一种分开，让它们分别显示出各自的特性，从而得到鉴定。选择性：采用抑制杂菌的条件，使待检菌生长的更好，利于分离。物理方法：厌氧条件培养厌氧菌、光照条件培养藻类等化学方法：根据微生物的营养需求，加入特制的促进或抑制生长的物质选择性培养基SelectiveMediaEMB(EosinMethyleneBlue)dyesinhibitGram(+)bacteriaselectsforGram(-)bacteriaG.I.TractinfectionscausedbyGram(-)bacteria四、定量计数法检品中的微生物有多少？计数直接（显微镜下计数、比浊法）间接（使菌繁殖）倾注平板法表面涂布法MPN法微菌落快速计数法“单个菌”“菌落”而计数统计学方法显微镜下计数微小菌落倾注平板法方法：使样品（1ml）均匀地分布到琼脂培养基中，培养后，计数菌落。怎样使样品均匀地分布到琼脂培养基中去？琼脂的特性：凝固的琼脂要在100℃以上才能融化，但融化后的琼脂要在45℃以下才会凝固。微生物：大多数在45℃时不会立即烫死。做法：融化后的琼脂培养基冷却到45℃时，加入样品混匀。加入多少样品才合适？使一个平板上生长的菌落数在30~300之间时，最利于计数。例如：食品中菌落总数的测定表面涂布法方法：使样品（0.1ml）中的微生物涂布在琼脂培养基的表面，培养后，计数表面生长的菌落数。比较：方法优点缺点倾注平板法接种量大（1ml），代表性好热琼脂对菌可能损伤表面涂布法可使用不透明的培养基；易于挑取菌落做进一步的分析；避免了热琼脂对菌的损伤接种量小（0.1ml），易出偏差MPN法利用统计学的方法对样品中的微生物计数。方法是把样品分成多个小份，根据小份样品待检微生物出现的阳性情况来推断样品中的菌数。卫生微生物研究和检测的方法目标：检测环境微生物的种类、数量。种类：纯培养（选择性增菌、分离）→鉴定→分型（血清学、噬菌体、细菌素、质粒图谱）数量：倾注平板法、表面涂布法、MPN法、显微镜直接计数法等环境中微生物检出困难：方法有特点：卫生指标菌的运用、样品的处理、损伤菌的复苏注意新技术的运用：PCR、核酸杂交、G+C含量测定、基因芯片、蛋白质芯片

思考题1.