禽流感细胞灭活苗的研究及H9亚型禽流感病毒感染猪的血清学调查

禽流感细胞灭活苗的研究及H9亚型

禽流感病毒感染猪的血清学调查硕士学位论文答辩研究背景:文献综述禽流感细胞灭活疫苗的研究H9亚型禽流感感染猪的血清学调查

报告内容一、研究背景

1.1禽流感疫苗的研究进展全病毒灭活疫苗

基因工程亚单位疫苗

重组活载体疫苗

核酸疫苗

流感减毒活疫苗

禽流感疫苗冷适应减毒活疫苗

重配减毒活疫苗基因工程减毒活疫苗

复制缺陷型流感减毒活疫苗表位疫苗

通用疫苗1.2禽流感检测方法的研究进展

病毒的分离鉴定

琼脂凝胶扩散试验（AGP）血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）

神经氨酸酶抑制试验（NIT）病毒中和试验（NT）

免疫荧光技术（IFT）

酶联免疫吸附试验（ELISA）

分子生物学诊断技术

禽流感的检测方法二、禽流感细胞灭活疫苗的研究灭活疫苗安全性好，免疫原性强，给免疫鸡群提供良好的免疫保护。目前已得到广泛的应用。细胞苗与传统的鸡胚苗相比，抗原性更接近自然流行株，可减少宿主蛋白成分，减少变态反应，避免鸡胚传代后引起抗原性变异。本试验将禽流感病毒H5N1接种MDCK细胞，通过收获细胞病变液经灭活制成细胞灭活疫苗，为HPAI的防控提供新的疫苗储备。

2.1研究的目的和意义敏感细胞株的筛选

高效价病毒毒株的筛选

病毒增殖滴度的研究

禽流感细胞苗的制备

病毒灭活效果检验疫苗物理性状检验疫苗的无菌检验疫苗安全性试验免疫保护力试验抗体消长规律试验疫苗保存期试验技术路线2.2试验方法、结果与分析敏感细胞株的筛选

代次细胞F1F2F3F4F5CEF2626252625MDCK2928282729Vero2525262422BHK-21232324240“2n”表示血凝价为nlog2

表2-1禽流感病毒在4种细胞上的血凝价结果表明，病毒在MDCK细胞上增殖的血凝价最高，达到27以上，且比较稳定。病毒在CEF、Vero和BHK细胞上的增殖滴度都比较低在26以下，也不适于选用。因此我们选用MDCK细胞用于细胞苗制备的细胞系。禽流感病毒接种MDCK细胞后20～36h开始出现呈现明显的细胞病变正常的MDCK细胞排列整齐，界限清晰病变的细胞变圆，脱落、颗粒增多，成片细胞之间有丝相连，成“拉网”结构。图2-1正常MDCK细胞与细胞病变

稳定、高效价病毒毒株的筛选F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10XSHA262625252625242300TCID5010-6.010-6.110-5.810-5.510-4.810-5.210-4.010-3.100JXHA2525242425242323220TCID5010-5.210-5.010-4.510-4.010-4.010-4.210-4.210-3.000XFYHA26252524242425232423TCID5010-4.310-4.010-4.010-3.510-4.510-3.010-4.010-4.010-3.510-3.5DWHA292828272728282928210TCID5010-7.010-7.110-7.510-7.510-7.010-7.210-7.110-7.510-7.110-7.5表2-24个AIV毒株在MDCK上传10代后的血凝HA效价和TCID50（TCID50/0.1mL）毒株XS、JX和XFY的血凝价和TCID50较低且不稳定，随着连续传代呈下降趋势。DW毒株的血凝价最高达210

，TCID50≧10-7.0/0.1mL。因此我们确定DW毒株为制苗用毒株。A/Chicken/HuBei/327/2002(H5N1)

病毒增殖滴度的研究

AIV代次F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10血凝价28282727262828282829TCID5010-6.810-6.810-7.010-7.110-7.510-7.210-7.510-7.310-7.310-7.8AIV代次F11F12F13F14F15F16F17F18F19F20血凝价28292122122102928282929TCID5010-7.510-7.410-7.510-7.810-7.510-7.510-7.810-7.710-7.610-7.7AIV代次F21F22F23F24F25F26F27F28F29F30血凝价210292921029282112921029TCID5010-7.510-7.410-7.510-7.610-7.910-7.810-7.810-7.410-7.810-7.5表2-3不同代次禽流感病毒在MDCK细胞上的血凝价和TCID50（TCID50/0.1mL）结果表明H5N1毒株经MDCK细胞接种培养30代后，血凝价稳定在28以上，TCID50稳定在10-7.0/0.1mL以上。随着代次的增加，血凝价和TCID50都逐渐上升且稳定，为疫苗的制备提供了高免疫原性的抗原。病毒的灭活及灭活效果检验灭活：以终浓度为0.4％的甲醛溶液灭活。灭活检验：将灭活的病毒液接种9～10日龄鸡胚，盲传3代后，全部鸡胚发育正常。说明病毒灭活彻底，保证了疫苗的生物安全。疫苗的安全性试验安全性试验：用制备的细胞灭活苗双倍剂量接种28日龄H5-AIV抗体阴性鸡10只，0.4mL/只，鸡群未出现异常反应和局部损伤。说明所制备的细胞苗安全性良好。疫苗的免疫保护力试验组别免疫剂量攻毒时间攻毒剂量免疫保护力健活数死亡数H5细胞灭活苗0.2mL免疫后21天0.2mL8/80/8H5尿囊液毒灭活苗8/80/8禽流感灭活苗（N28株，哈兽研）8/80/8空白对照（无菌DMEM培养基）0/88/8将疫苗免疫H5抗体阴性鸡21d测得HI抗体水平达到29，用100LD50的H5N1-AIV进行攻毒。表2-4各免疫组攻毒保护试验

结果表明，各免疫组鸡全部健活，保护率为100%。空白对照组鸡攻毒后24h开始出现精神萎靡、流泪、呼吸困难、颜面水肿、羽毛松散等症状，并出现死亡，在5天内全部死亡。说明研制的H5亚型禽流感病毒细胞灭活苗免疫效果良好，与尿囊液灭活苗和禽流感灭活苗（N28株，哈兽研）的免疫保护率相当，可以对同亚型的病毒攻击起到保护作用。抗体消长规律试验

疫苗免疫后7天开始检测到抗体，至第3周抗体水平上升较快，HI效价均达到29以上。从第3周至第7周，抗体水平持续缓慢地上升至29～211。到第8周抗体水平开始缓慢下降，至36周细胞苗组的抗体在25左右。空白对照组鸡的抗体一直在24以下，禽流感抗体阴性。说明制备的细胞苗免疫效果可以维持9个月以上。HI效价(log2)免疫后时间（周）

保存期试验

存放时间HI抗体7d14d21d28d35d60d6个月25.226.029.8210.129.829.210个月25.026.229.5210.029.829.0对照组000000疫苗保存10个月后免疫鸡，28d高峰可达210.0。因此该疫苗保存期暂定10个月（4-8℃）。

将疫苗置于4℃保存6、10个月后均未出现分层破乳现象。疫苗免疫鸡后，无不良反应。

表2-5保存期试验结果免疫抗体水平

2.3小结本试验筛选了MDCK细胞和DW毒株A/Chicken/HuBei/327/2002(H5N1)为本试验制苗用细胞系和毒株。研制了H5亚型禽流感细胞灭活苗，并对其免疫效果进行了评价，该疫苗对同亚型病毒的攻击能提供100%保护。抗体持续时间达到9个月，4℃保存期为10个月。三、H9亚型禽流感感染猪的血清学调查3.1研究的目的和意义禽流感已突破种属障碍感染人并致人死亡。H9N2在猪中也分离到，且能直接感染人。猪是禽流感病毒和其他流感病毒的混合器，在禽－猪－人的种间传播中起到非常重要的作用。做好对猪群的监测，建立一套早期预警体系，即可提前预报流感大流行。本实验利用建立的H9HA-ELISA诊断方法，对来自湖北、湖南和安徽三省的949份猪血清进行了血清学分析。技术路线抗原的制备抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定阴阳性界线的确定分析特异性试验重复性试验符合率试验诊断特异性试验诊断敏感性试验ELISA诊断方法的建立猪的血清学检测

H9-HA蛋白SDS结果

图3-1原核表达载体pKG-H9HAM诱导表达产物的SDS检测1:pKG-H9HAM;2:pGEX-KG结果显示：含pKG-H9HAM重组质粒的E.coliBL21在约90KDa处有明显的表达带，H9HA蛋白约63KDa，与GST融合后约为90KDa。而含pGEX-KG的E.coliBL21的对照在约26KDa有明显的表达带，相当于GST蛋白的分子量。说明目的基因获得了表达。

3.2试验方法、结果与分析ELISA抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定AgDilutionSerumDilutionABCDEFGH1:101:201:401:801:1601:3201:6401:1280+11：102.0111.8021.7961.6131.5641.5321.2011.01821：201.9211.7191.6161.5991.5541.5191.0780.93531：401.8221.6831.6591.5161.5141.4580.9760.84541：801.8101.6171.6511.4631.4461.1730.6700.45151：1601.5981.5081.5571.1271.0310.6530.4130.35561：3201.4271.3421.4161.0160.7730.4620.4180.311_71：100.5010.4540.3520.2620.2530.1780.1760.13581：200.4840.4670.2490.2350.2060.1390.1080.09891：400.4450.4460.2590.2080.1840.0670.0590.045101：800.4180.4080.2150.1510.1240.0780.0550.057111：1600.3650.3540.1260.0920.0630.0290.0410.045121：3200.2470.2760.1030.0530.0400.0180.0210.021表3-1ELISA方阵滴定结果

ELISA阴阳界限的确定

将临床送检经HI检测为阴性的100份猪血清，进行ELISA检测均为阴性，计算该100份血清的OD630nm平均值X=0.143，标准差SD=0.087，因而根据公式X+3SD求得阴阳界限为0.404。结果判定：以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD630nm值

OD630nm≥0.404判为阳性；

OD630nm＜0.404判为阴性。重复性试验批内重复的吸收变异系数C.V在4.9％-8.4％之间；批间重复的吸收变异系数C.V在5.3％-9.5％之间。说明该诊断方法具有良好的重复性。分析特异性试验

血清阳性血清血清样品12345678910OD6300.1020.1230.0980.1040.0890.1010.1110.0791.3050.1031)弓形虫；2)猪瘟；3)胸膜肺炎；4)口蹄疫病毒；5)伪狂犬病毒；6)细小病毒；7)乙脑病毒；8)猪繁殖与呼吸道综合症；9)猪抗H9-AIV阳性血清；10)阴性血清上述结果表明该ELISA方法检测弓形虫、猪瘟等8种猪病阳性血清均无交叉反应，检测H9-AIV猪阳性血清结果为阳性，阴性血清结果为阴性，表明该方法的分析特异性良好。表3-4分析特异性试验结果诊断特异性、敏感性与符合率试验

血凝抑制试验（HI）合计＋－ELISA＋14225167－11236247合计153261414根据公式计算得该ELISA方法的诊断敏感性为92.8%；特异性为90.4%；总符合率为91.3％说明该方法具有良好的诊断特异性、敏感性与符合率。表3-5ELISA方法的诊断特异性、敏感性与符合率猪的血清学调查

湖北湖南安徽2-3月份9-10月份2-3月份9-10月份2-3月份9-10月份哺乳仔猪检测数434045313235阳性数211001阳性率4.7%2.5%2.2%0.0%0.0%2.9%保

育猪检测数404129413642阳性数320011阳性率7.5%4.9%0.0%0.0%2.8%2.4%育

肥

猪检测数503843474538阳性数303243阳性率6.0%0.0%7.0%4.3%8.9%7.9%种猪