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文档简介
生物制药班小组成员:李新张妮台影杨晨石维丽王欣欣动物肝脏中DNA的提取1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。3、学习核酸染色的方法。一、实验目的:二、实验原理:要获得纯的DNA样品,必须考虑以下几点:如何选材,如何破碎组织细胞?如何除去蛋白质?(在真核细胞内,DNA与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此,分离DNA时必须使其与蛋白质解离,并除去蛋白质。)设法除去RNA的污染;防止DNA酶的降解作用;(一)动物肝脏DNA制备原理基因组DNA的提取方法
浓盐法:利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。离子去污剂法:利用SDS、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)等去污剂是蛋白质变性,直接从生物材料中提取DNA。苯酚抽提法:苯酚既是蛋白变性剂,又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆时,由于蛋白与DNA连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性集团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。选材要提取动物组织DNA,一般选择细胞膜较脆弱,容易破碎的动物脏器,如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。除去RNA的方法
脱氧核糖核蛋白在浓NaCl(1-2mol/L)溶液中溶解度很大,但在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度很低,而核糖核蛋白则溶于0.14mol/LNaCl溶液中,利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。
除去蛋白质的方法
用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液,使蛋白质变性,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。纯的DNA样品的获得为了防止DNA酶的降解,提取时可加入适量EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸,以降低DNA酶的活性。加入RNA酶降解剩余的RNA,获得纯的DNA。保存:将DNA于滤纸上干燥,溶于1mlTE中低温保存。
(二)琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理:琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法,是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法,已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。琼脂糖英文名agarose,是从琼脂中提取出来的,由半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶,电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少,电渗作用降低,因而分离效果明显提高。荧光来自两方面,一是核酸吸收260nm的紫外光,并将能量传给EB;二是EB本身吸收波长为302nm和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为590nm的红橙色荧光。溴化乙啶可加入凝胶中,也可以在电泳后,将凝胶放在含EB的溶液中浸泡.溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高,可检出10ng甚至更少的DNA。(一)材料:动物肝脏
(二)试剂:
(1)0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA-Na溶液:(2)20%SDS溶液:(3)氯仿一异戊醇(24:1)混合液:(4)95%乙醇溶液。(5)80%乙醇溶液。(6)pH8.0TE缓冲液:10mmol/LTris-HCI,lmmol/LEDTANa,其中含RNA酶20ug/mL。二、实验材料、试剂和仪器:
(7)电泳缓冲液:Tris-硼酸-EDTA(50×TBE)pH8.0。(8)加样缓冲液:0.25%溴酚蓝(BPB)40%蔗糖。(9)溴化乙啶(EB)溶液:10μg/ml。(10)琼脂糖凝胶:浓度为0.7%。(三)仪器(1)稳压稳流电泳仪(2)可调微量移液器
(3)水平电泳槽(4)暗箱紫外透射仪等。三、实验步骤:1.取新鲜动物肝,称取1g,切成小块,加入2ml0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA溶液,于研钵中研磨至匀浆,再加2ml清洗转入离心管中,以4000r/min的转速离心10min。2.在上述沉淀物中加入2mL0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA溶液,然后在60℃下,滴加20%SDS溶液3-5滴,边加边摇动,再摇动10min,使核酸与蛋白质分离。3.加固体氯化钠0.2g混匀,使其最终浓度达到l.4mol/L,水浴30min。
4.加等体积的氯仿一异戊醇,混匀,摇动5min,以4000r/min的转速离心10min。离心管内的物质分为三层,上层为含DNA的水相层,下层为氯仿一异成醇混合物,中间层为变性蛋白凝胶。5.吸出上清液,加入2倍体积95%乙醇溶液(预冷),产生沉淀。6.再以4000r/min的转速离心溶液10min,弃去上清液(沉淀用80%乙醇溶液离心洗涤)。7.将沉淀置于吸水纸上,除尽乙醇,室温自然干燥后,加入200ul电极缓冲液,使DNA充分溶解,待用。8.凝胶板的制备:(1)取琼脂糖0.7g,加1×TBE缓冲溶液100ml,于沸水浴中至熔化,制成0.7%的琼脂糖胶液。(2)胶床两头贴上防水胶带,形成8mm高的挡墙,压紧胶带,置水平台面上。(3)插入梳子,梳齿下端离板底0.5-1mm。(4)在胶床上滴加2-3滴0.5μg/mL的EB溶液。(5)将60℃凝胶不间断倒入胶床,高3-4mm,避免气泡,摇匀,室温下凝固。(6)完全凝固后,撕掉胶带,置于电泳槽中,加入电泳缓冲液,高于胶面1-2mm,从一头轻轻斜拉出梳子,除去产生的气泡。9.加样:
将样品DNA溶液与加样缓冲液以5:1的体积比混合,用微量移液器加样,每加完一个样品,冲洗三次。加样量15~20l(加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部)。10.电泳:为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不应高于5V/cm(两电极间的距离)开始时用较高电压(80V),样品一进入胶内则将电压调至5V/cm。当染料前沿移至底边1-2mm时,电泳毕。11.观察
关闭电源,取出胶床,在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA(
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