动物肝脏DNA提取

生物制药班小组成员：李新张妮台影杨晨石维丽王欣欣动物肝脏中DNA的提取1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。3、学习核酸染色的方法。一、实验目的：二、实验原理:要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点：如何选材，如何破碎组织细胞？如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。)设法除去RNA的污染；防止DNA酶的降解作用；（一）动物肝脏DNA制备原理基因组DNA的提取方法

浓盐法：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。离子去污剂法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂是蛋白质变性，直接从生物材料中提取DNA。苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆时，由于蛋白与DNA连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性集团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。选材要提取动物组织DNA，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。除去RNA的方法

脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，但在0.14mol／LNaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／LNaCl溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。

除去蛋白质的方法

用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。纯的DNA样品的获得为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性。加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。

（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为590nm的红橙色荧光。溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡.溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。(一)材料：动物肝脏

(二)试剂：

（1）0.14mol／LNaCl－0.15mol／LEDTA-Na溶液：（2）20％SDS溶液：（3）氯仿一异戊醇(24:1)混合液：（4）95％乙醇溶液。（5）80％乙醇溶液。（6）pH8.0TE缓冲液：10mmol／LTris－HCI，lmmol／LEDTANa，其中含RNA酶20ug／mL。二、实验材料、试剂和仪器:

（7）电泳缓冲液：Tris-硼酸－EDTA（50×TBE）pH8.0。（8）加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（BPB）40%蔗糖。（9）溴化乙啶（EB）溶液：10μg/ml。（10）琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。(三)仪器（1）稳压稳流电泳仪（2）可调微量移液器

（3）水平电泳槽（4）暗箱紫外透射仪等。三、实验步骤：1．取新鲜动物肝，称取1g，切成小块，加入2ml0.14mol／LNaCl－0.15mol／LEDTA溶液，于研钵中研磨至匀浆，再加2ml清洗转入离心管中，以4000r／min的转速离心10min。2．在上述沉淀物中加入2mL0.14mol／LNaCl－0.15mol／LEDTA溶液，然后在60℃下，滴加20％SDS溶液3－5滴，边加边摇动，再摇动10min，使核酸与蛋白质分离。3.加固体氯化钠0.2g混匀，使其最终浓度达到l.4mol／L，水浴30min。

4．加等体积的氯仿一异戊醇，混匀，摇动5min，以4000r／min的转速离心10min。离心管内的物质分为三层，上层为含DNA的水相层，下层为氯仿一异成醇混合物，中间层为变性蛋白凝胶。5．吸出上清液，加入2倍体积95％乙醇溶液（预冷），产生沉淀。6.再以4000r／min的转速离心溶液10min，弃去上清液(沉淀用80％乙醇溶液离心洗涤)。7．将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥后，加入200ul电极缓冲液，使DNA充分溶解，待用。8.凝胶板的制备：（1）取琼脂糖0.7g，加1×TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的琼脂糖胶液。（2）胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。（3）插入梳子，梳齿下端离板底0.5－1mm。（4）在胶床上滴加2－3滴0.5μg/mL的EB溶液。（5）将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm，避免气泡，摇匀，室温下凝固。（6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面1－2mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。9.加样：

将样品DNA溶液与加样缓冲液以5：1的体积比混合，用微量移液器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量15～20l（加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部）。10.电泳：为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V)，样品一进入胶内则将电压调至5V/cm。当染料前沿移至底边1-2mm时，电泳毕。11.观察

关闭电源，取出胶床，在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA（