植物mirna跨界研究项目建议书-deep sequencing project plant animal

Presentedby:ChunzhiJin,TechinicalSupportApril11,涉及到LCSciences的公司商业，请确保 内容您个人科研使用，并承担责 的内容，根据国家有关法律、，LCSciences公司将有 大学 miRNA的基本信息：microRNA(microRNA)是真核生物体内一类具有 织特异性和发育阶段特异性，通过互补配对结合并剪切mRNA 或者抑制mRNA的翻译从而 的表达。目前在miRbase（SangermiRbase18.0,2011-11-18）microRNA研究 库中已有168个物种23215条microRNA成熟体 ，其中4677条microRNA是隶属52种植物。这52种植物绝大多数可以作为食物供人类或者其他哺乳动物食用，也有少数的中药植物，如地黄（Rehmanniaglutinosa）。动物体内植物miRNA的研 ：2011年8月份 教授在Cell上EgestMacicytetsanLRP:evenefckgmgtnycR1Ra：cRA描述如下：“RA（cs）是一类长度在t的非编码RA，它产自其发夹前体，通过与靶的3’Rs区域互补配对介导%的蛋白质编码的转录后沉默。McRAcRA的异常将会导cRcA表达谱可以作为以及其他一些的新的生物标记。大量研究显示特定的循环系统游离cRA面上的受体/配体，并且具有选择性作用于靶细胞的功能。它能够通过在细胞间生物活性油脂、A和其他囊泡结构的组合体，而且许多的超微小泡包含着cRs。进一步的研究表明，cRA可以选择性的包入超微小泡，并且能够自主的运送到受体细胞，而外源性的cRs达体的能，泌cRs导胞讯号子种泌cRA重功有其研过现环cRA间和细胞器间信号转导的新的研究领域。在张教授的研究中他们很惊奇的检测到人类和哺乳动物血浆内的外源性植物cRA。大约半数的植物RA在和血浆的超微小泡Ra入到循环系统和不同的尤其是肝脏中，并且跨物种调控小鼠的低密度脂蛋白受体接头蛋白LLRPmicroRNA可以通过食物进入哺乳动物肠道，进入血液循环系统以及肝脏中跨物种对哺乳动物的mRNA进行调控。miRNA的区别：microRNAmicroRNA都存在着很大的差异，植物microRNA在最后一个核苷酸的核糖上有一个天然的甲基化的羟基大大增加了植物microRNA分子的稳定性。进行miRNA 时，miRNA文库构建是利用到其在5‘端的磷酸基团和3‘-羟基才能在两端加上接头，在接头中引入引物进而上机的。如图，为哺乳动物和植物microRNA的3‘末端最后一个核苷酸，植物microRNA的3‘端最后一个核苷酸的核糖上2‘-OH有一个甲基Me修饰变成2‘-OMe。microRNAmicroRNA3‘2‘-O-Me的存在而比哺乳动物microRNA的的时候需要的时间。另外，哺乳动物的microRNA由于不存在这个2‘-O-MemicroRNAmicroRNA建库的过程中加入高碘酸处理而除去样品中的哺乳动物microRNA，仅对植物来源的microRNA在血中测些药食的外性cR高的技会比cRA合适，除了新一代的高通量的技术具有极其深度的动态检测范围的优势可以检测到个位数量级的表达量，能满足低丰度外源性cA的检测外，联川生物技术公司研发人员对 的深入研究，特别对于某些特殊样品尤其是血浆样品的microRNA 了从RNA提取到小RNA建库到数据分析过程中的一些改进的策略。具体的说，依据血血中可以检测出的microRNA来作为RNA的质控指标，依据动植物microRNA的是否有2’-Ome甲基修饰基团，而在建库策略里面进行3’端接头连接过夜的步骤，增强植物microRNA的 率，保留最多数的植物miRNA的检出。此外，由于 、血浆中的存在的miRNA种类较少，并且无法用常规的电泳以及OD值检测其RNA提取质量。为了很好地检测 、血浆样品中可以检测到的动物microRNA（let-7a，miR423-5p，miR-21，hsa-miR-16，hsa-miR-103，hsa-miR-192，hsa-miR-93，hsa-miR-451），我们选择其中部分作为提取RNA ，而外源性植物microRNA中可以选定miR168来作为质控 ，应用荧光定量PCR技术定量这些质控，从而判断所提取的RNA是否保留有microRNA以及外源性的microRNA。此 、血浆本身的RNA就很少，所以采取富集性的提取小RNA，然后再建库。通过上述针对性的实验策略更好的进行哺乳动物体内外源性植物（主要是中药或者食物中）cR研究。数据分析cA殊样品中的外源性RA ，血浆外，还可以增加肝脏，也即肝脏中也是存在外源性microRNA的，这也是一个很好的切入点。并且肝脏组织中的哺乳动物microRNA还可以使用高碘酸氧化去除，仅对动物样品中植物microRNA进行数据分析和研究。 存在植物性mcroRNA的哺乳动物样品，可以是血液，和血浆，最好是血浆，肝脏的可检出microRNA进行定量鉴定的RNA质控步骤。对样品分别进行smallRNA文库构建，建库过程中3‘端接头连接过夜，保留植物性microRNA。而对于肝脏样品，除了建库过程中，3‘端接头连接过夜，保留植物性microRNA，还可以选择高碘酸处理过程，去除其中的哺乳动物microRNA，进而单纯的对哺乳动物肝脏中的植物microRNA进行研究。smallRNAmiRbase版的所有植物已microRNA进行零错配比对（零错配是为了增加研究结果的可靠性）。获得样品中的植物microRNA序列。microRNA在哺乳动物体内的可能的靶，获取这些microRNA在动物体内发挥的功能信息。并且可以对不同处理样品中的植物性microRNA表达量进行差异比较。小贴和血浆RNA样品和血浆样品的microRNA表达谱分析虽然有广阔的应用前景，但仍需克服几个难题才能确保实验成功进行。首先，血浆 是无细胞样品，RNA的含量很低。这意味着使用 yzer或OD值测定等普通的质控方法并不适用于这些样品其次，即使是从血浆或 中提取的最纯的RNA也包含qPR反应的反转录酶和Tq聚合酶抑制剂。最后，某些大RNA分子常用于PCR规范化，U6RNA，在 和血浆中的含量非常低。如何 血浆或中在选择哪种样品进行实验时，优先选择血浆，原因之一是血浆所用的采样方法更加可靠。此外，血浆的q值稍低一些，说明它的micrRNA含量更高。通常情况下，选取用柠檬酸或EDTA等抗凝剂的血浆样品，因为这些血浆方法在后续的micrRNA表达谱实验中能得到更好的结果。建议不要使用肝素抗凝血浆。正确收集和血液血浆血浆和的第一个步骤是全血。这个过程所的主要在于细胞RNA在体外的不稳定性。文献称，在室温下贮藏或时，全血中单个RNA种类（如mRNA）的拷贝数变化可能会超过1000倍。这是由RNA快速降解和抽血后某些特定的诱导表达共同造成的。RNA表达谱的这些变化使研究全血的表达变得不可能。虽然和血浆中的RNA种类相对来说不受诱导表达的影响，它们仍会受到降解RNA酶的影响。因此，为了准确分析血液血浆和中的表达，必须找到一种方法可以在全血过程中或之后保护RNA表达谱不受影响。通常，建议将全血立即制成或血浆。在从全血到和血浆的所有操作步骤中，应采取措施防止细胞裂解，否则可能会导致和血浆完整细胞的RNA会掩盖或 后续microRNA表达谱微小变化的检测。在样品 过程中，建议采样过程使用详细和固定的流程，避免这个步骤引入数据的技术变化。另外，样品应该在相近的条件下 - C。如果可以，应尽快进行RNA分离操作。延长时间保存时，血浆 中的RNA通常在高于- 的温度下比ZhangL,HouD,ChenX,LiD,ZhuL,ZhangY,LiJ,BianZ,LiangX,CaiX,YinY,WangC,ZhangT,ZhuD,ZhangD,XuJ,ChenQ,BaY,LiuJ,WangQ,ChenJ,WangJ,WangM,ZhangQ,ZhangJ,ZenKandZhangC-Y.ExogenousplantMIR168aspecificallytargetsmammalianLDLRAP1:evidenceofcross-kingdomregulationbymicroRNA[J].CellRes,2011,1-YuB,YangZ,LiJ,MinakhinaS,YangM,PadgettRW,StewardRandChenX.MethylationasaCrucialStepinPlantmicroRNABiogenesis[J].Science,2005