分子生物学第08章PCR-聚合酶链反应

8.1PCR的基本原理8.2PCR条件的优化8.3由基本PCR扩展的相关技术及其应用8PCR－聚合酶链反应PCR的特点

聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）是一种体外扩增DNA片段的方法，与用载体和宿主细胞的体内扩增相比，有简便、快速的优点，并有许多特殊的用处。PCR的基本原理一PCR的基本原理二图8－1PCR的基本原理PCR反应的体系DNA模板一对引物耐热的DNA聚合酶4×dNTP缓冲液Mg2+、K+离子酶活性保护剂PCR仪

PCR仪实际上就是一种温度循环仪，它能够快速地升降温和保持恒温，全部由电脑控制。常用的反应容器有0.2ml的薄壁Eppendorf管和毛细玻璃管。对DNA模板的要求

对DNA模板纯度的要求不很高，但必须除去DNA聚合酶抑制剂。理论上有一个DNA模板分子就可以扩增出大量的产物，实际上使用pg~ng级的模板量。模板一般是双链分子，也可以是单链分子。模板DNA分子不宜太长，可用切点稀少的限制酶切成较短的片段。由于环状DNA模板的扩增效率较线状DNA模板低，所以最好先将环状DNA用限制酶切成线状再行扩增。RNA模板应先逆转录成cDNA再进行PCR扩增。引物长度一般为15~30个核苷酸。引物太短与模板结合的位点特异性差，引物太长与模板结合的速率下降，影响PCR的效率。不应有超过3个连续的C或G。引物自身不存在互补序列，两个引物之间也不能有超过4个连续碱基互补的情况。当引物的3’端有足够长与模板互补的序列时，引物的5’端可以不与模板互补，利用这点可在PCR产物的两端加上特殊序列（如限制性内切酶位点）。图8－2引物5’端外加BamHⅠ酶切

位点掺入产物的两端引物为了方便PCR产物的检测和分析，可以在引物的5’端以同位素或非同位素修饰（32P、荧光素、生物素等）。当要扩增的DNA序列不知，但知其编码的氨基酸序列，可反推出DNA序列，为设计引物提供依据。因简并密码的存在，反推出的DNA序列是不唯一的，这时应采用简并引物。表8－1引物5’端修饰技术修饰法用途修饰法用途1.附加核酸序列2.功能基因修饰酶切位点便于克隆等同位素(35S,32P)检测，定量噬菌体启动子测序，合成RNA探针等生物素检测，纯化，定量蛋白质结合序列产物纯化，检测荧光素检测，纯化酶检测TaqDNA聚合酶

现在常用的Taq酶，在95℃的变性温度下（20秒），经过50次循环仍保持65%的酶活性。对于Taq酶的聚合酶活性来说，最佳作用温度为75~80℃，60℃时聚合酶活性仅剩1/2，37℃时聚合酶活性仅剩1/10。但在许多情况下，需要在低于最适温度条件下进行聚合反应，以免引物从模板上解离下来。TaqDNA聚合酶

Taq酶有5’→3’的聚合活性和5’→3’的外切活性，但缺少3’→5’的外切活性，所以没有校正功能，有时会发生错误合成。使用Taq酶还往往在所有扩增产物的3’端增加一个非模板依赖的A。现在作为商品供应的Taq酶有从嗜热水生菌中提纯的天然酶和利用大肠杆菌生产的基因工程酶。

PCR的反应体系

PCR中常用的缓冲液是10～50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH8.3～8.9，还需要合适的Mg2+浓度（约1.5mmol/L）和K+浓度（50mmol/L），其中Mg2+浓度须经过预备实验确定合适的值，在0.05mmol/L和5mmol/L之间试验，按每0.5mmol/L增加。Mg2+浓度太高时非特异扩增增加，太低时产物减少。PCR的反应体系

Taq酶的用量必须适当，一般典型的扩增反应加2单位的酶，太高非特异扩增增加，太低时扩增效率下降。4种dNTP的浓度应相等，浓度在20～200μmol/L之间。反应体系中加入BSA或明胶可以保护Taq酶活性。在无热盖的PCR仪上，反应液表面应加矿物油以阻止蒸发。循环条件的设定变性---------→退火----------→链延伸循环变性退火链延伸首轮循环94℃5min50℃2min72℃3min中间循环94℃1min50℃2min72℃3min末轮循环94℃1min50℃2min72℃10min循环条件举例循环条件的设定

在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。退火温度较低可提高扩增效率，但产物的特异性较差；退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。嵌套PCR(nestedPCR)嵌套PCR提高产物特异性的原理单用第一对引物扩增，得一特异性产物和一非特异性产物。单用第二对引物扩增，得一特异性产物和一非特异性产物。以第一对引物扩增的产物为模板，用第二对引物再次扩增，只得到特异性产物。特异性产物特异性产物非特异性产物非特异性产物反向PCR(invertedPCR)锚式PCR(anchoredPCR)RACERapidAmplificationofcDNAEnds扩增mRNA3’端或5’端的序列称为RACE。锚式PCR扩增已知序列3’侧序列锚式PCR扩增已知序列5’侧序列锚式PCR扩增全长的mRNA序列

要扩增全长的mRNA，先用oligo(dT)作引物逆转录该mRNA成全长的cDNA第一链，再给cDNA第一链的3’端进行同聚物加尾（如GGGGG），最后用oligo(dT)和oligo(dC)进行扩增。

不对称PCR(asymmetricPCR)定量PCR

严格地掌握实验条件，使PCR扩增产物量与模板量成正比。这样可将痕量的模板扩增后检测，从而得到原模板的量。此法常用于低丰度mRNA的检测。先将mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板扩增出产物，检测产物的量从而推算出低丰度mRNA的量。这种方法称为反转录PCR（RT－PCR）。(quantitativePCR)定量PCR中的内标

由于影响扩增产量的因素较多，模板与扩增产物量的比例关系难以确定，所以必须在同一次PCR中加入内标。在一次PCR中同时加入两种模板，一种是待测模板，另一种是按确定量加入的作为内标的对照模板，二者使用相同的引物，对照模板与待测模板的差异应尽量小，以便最大程度地减少扩增效率的系统误差。对照模板扩增产物和待测模板扩增产物必须能由电泳分辨出来，比如二者的分子量有一定的差异，或是二者序列中有限制酶切位点的差异。

荧光定量PCR

1995年美国PerKinElmer公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术，它融合了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点。荧光定量PCR是直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作，在整个过程中，仅有加入样品的一次开盖。

TaqMan荧光探针（线性探针）在PCR扩增体系中加入一个特异性的、能与PCR产物中部杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收，结果是没有荧光出现。PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切活性将探针酶切降解，使R基团与Q基团分离，Q基团对R基团的荧光淬灭作用消失，于是产生荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个R基团分离，游离的R基团数量（也就是荧光强度）与PCR产物的形成完全同步。通过检测荧光强度的变化，机内的电脑可以计算并直接给出初始模板的数量。

TaqMan荧光探针工作原理分子信标（环状探针）分子信标荧光探针的设计与TaqMan荧光探针相似，只不过探针的5’端和3’端的一小段序列被设计成互补的，探针没有与靶序列杂交时会形成茎环结构，R基团和Q基团靠近，不能产生荧光。当分子信标与靶序列杂交时，茎环结构被展开，使得R基团和Q基团分开足够远，Q基团对R基团的荧光淬灭作用消失。余同前。SYBR荧光染料在PCR反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链中，产生荧光信号，而不掺入DNA双链中的SYBR荧光染料不会发出荧光。这样荧光强度就与双链DNA的量成正比。

荧光定量PCR仪光路图PCR产物与载体的连接解决办法：用T4DNA聚合酶除去PCR产物3’端多余的核苷酸，成为平端后连接。给平端