RNA加工水平的调控

三、

RNA加工水平的调控

RNA加工：剪切

(cleavage)修剪

(trimming)剪接

(splicing)修饰(modification)戴帽”

(capping)m7Gppp—“接尾”

(tailing)PolyA.编辑

(editing)RNAi降解（一）切除多余序列1.

基因间序列的除去2.

内元的除去可变剪接(alternativesplicing)调控基因的表达，以适应生理的需求。可变剪切的结果，一个单基因转录得到的mRNA前体，可以产生多个蛋白质，即蛋白质同源体(isoform)。（二）碱基修饰

差不多所有RNA都是含有不同数量的修饰成分，尤以tRNA和snRNA为最多。迄今RNA中的修饰成分发现已近百种，但对其功能的认识还不多。（三）RNA编辑

1986年Berme等人从锥体虫中发现的一种新的RNA加工方式。当时发现锥体虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(CoⅡ)基因与酵母或人的相应基因相比，在编码蛋白的170位氨基酸附近有一移码突变。比较锥体虫CoⅡ基因与其转录物的序列，发现转录序列在相应上述移码突变位点附近有四个不被基因DNA所编码的额外的尿苷酸，这四个尿苷酸正好校正了基因的移码突变。

480490500510

mRNA：

UUAGGUAUAAAAGUAGAUUGUAUACCUGGUAGGUGUAAU蛋白序列

：L

G

I

K

V

D

C

I

P

G

R

C

N

DNA：

TTAGGTATAAAAGTAGA**G*A*ACCTGGT

AGGTGTAAT核酸序号以mRNA起始密码AUG的A开始编号。下划线标出与人及酵母相应蛋白相同的氨基酸。锥体虫T.buucei亚种mRNA的编辑(不是全部)mRNA起始密码

编辑区域

5’区

编码区

3’及PolyA

区CoⅡ+／－

4／0CoШ－／？

394／1832／1Cyb

+／

+34／014／0MURF2－／+26／4

斜线坐标时插右边表示删去U。斜线右表示基因中有无起始密码。右边表示编辑中有无构建起始密码。MechanismofedtingRNAeditingiscatalyzedbyacomplexwithsevenmajorpolypeptides,twoofwhichcorrespondtodistinctligases.UdeletionandUinsertioninvolvegRNA-directedendonucleasecleavageofthepre-mRNA(shownbyanarrowhead),either3'-U-exoorTUTaseactingontheupstreamfragment,andRNAligaserejoiningthemRNA.R,purine(s);Y,pyrimidine(s).Thesetwoformsofeditingusedistinctcleavageactivitiesanddistinctligaseenzymes,andthe3'-U-exoisnotareverseTUTasereaction,whichisindicatedbytheunequalsign.gRNAshavethreemainportions:a5'regiontoanchorthegRNAtothemRNAjustdownstreamoftheeditingsiteanddirectthecleavage,acentralregiontoguidetheUdeletionsandinsertionsatmismatchesinbasepairingwiththepre-mRNA,anda3'oligo(U)thatmaytethertheverypurine-richupstreampre-mRNA.ManyadditionalconservedgRNAfeatureshavealsobeennoted.Dottedlinesindicatepotentialbasepairsthatcouldserveinaligationbridge.Modelofthe19Sand35–40SRNAeditingcomplexesrevisited.Polycistronic

minicircletranscriptsassembleinto19SgRNAprocessingcomplexes,whichprocessthe5'mostgRNAsintomonocistrons(grayboxes).Thesecomplexesfurtherassociatewithpre-editedmRNAandotherproteinstoform35–40SRNAeditingcomplexesthatproduceeditedmRNAs.Red,

endonuclease;yellow,TUTase;green,RNAligase;closedarrowhead,editingsite.CurrentunderstandingofUdeletionandUinsertion.

编辑的生物学意义1.校正移码突变：CoⅡ2.控制转译：产生起始密码，MURF2

除去起始密码，锥体虫(C.fasciculate)MURF-3

产生终止密码，T.brucelCoШ.3.扩充遗传信息。T.burceil

Cyb基因:在其固有起始密码上游构造新的起始密码，从而扩展了21个核苷酸的转译序列。另外两种锥体虫C.fasclculata和L.tarentolae的CoШ基因也用这种方法增加了18个密码子。T.brucel的CoШ最突出，在158个位点插入394个U，在9个位点删去18个U，实际增加376个U，增加数占成熟的CoШ转录物编码区总长度的55％。RNA编辑是对中心法则的重要补充。（四）反义RNA

基本原理是通过碱基配对与mRNA结合，形成二聚体阻断其表达功能。1.

反义RNA在胞质内与mRNA形成RNA:RNA二聚体使其不能与核糖体结合。2.

反义RNA在核内与新生mRNA结合，二聚体不能运输出核外。3.

反义RNA：mRNA二聚体易被酶降解。4.碱基修饰作用。mRNA中A转变为

I，

AI，

I-U对不稳定，可使双链拆开。（五）RNA干涉(RNAinterference,RNAi)

与microRNAs（miRNAs)

RNA干涉是1998年首次在线虫(C.elegans)中发现并证明的转录后水平的基因沉默机制，利用双链RNA的介导可以特异性地降解相应的mRNA，阻断相应基因的表达，随后发现这种现象广范存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。RNAi和miRNA的特征转录后水平的基因沉默机制具有很高的特异性能够非常特异地降解与之相应的单个内源基因的mRNARNAi抑制基因的表达具有很高的效率，远远少于内源mRNA的数量的双链RNA能完全抑制相应基因的表达。这表明很可能存在干涉效应分子的扩增机制。RNAi抑制基因表达的效应可以在不同细胞间长距离传递和维持，在线虫中干涉效应甚至可以传到后带中去，这说明RNAi干涉机制中可能存在维持mRNA降解序列特异性的信号小分子。RNAi的意义及应用前景生物的watchdog

抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列的过度增殖，对生物体的发育和基因的调控可能也有重要作用。产生抗病毒的植物和动物研究新基因的功能人类疾病的基因治疗国外医学分子生物学分册２５（５）P267－２６９。RNAi的作用机制及其应用。２００３（六）mRNA的降解mRNA的结构国外医学分子生物学分册２４（３）P１４３－１４６。真核生物中降解机制研究进展。２００２影响mRNA稳定的因素5’端帽子结构5’非编码区（5’－UTR)开放阅读框的降解序列3’非编码区（3’－UTR)IRE（铁离子相关区域），ARE－BP在一般的细胞RNA代谢中起着重要作用，其结合力受细胞内铁离子的调节，保护mRNA的稳定性。

ARE（A-U富集区），含50－150碱基，有多个AUUUA重复序列，U的百分比含量对稳定有重要意义。polyA和PABPHumanPABPMW72000KD形成25－27核苷酸结合区。1.脱腺苷酸依赖型降解真核细胞中最主要的降解方式，其降解过程如下：

polyA核酸水解酶水解polyA尾巴，polyA缩短。polyA能结合一种称为polyA结合蛋白(PABP)的特异蛋白，只有当polyA缩短至10－15个残基时，PABP便不能与之结合，脱帽过程被启动。脱帽时由脱帽酶Dcp1切除mRNA5’端鸟苷酸形成的帽子结构。脱帽后的mRNA很容易被5’3’核酸外切酶识别水解，另外真核生物的mRNA也可以在脱腺苷酸后以3’5’方向被降解，但这种作用很小。脱polyA尾巴的调节

Poly(A)核酸酶的活性受Ccr4和Caf1的正调节脱帽过程的调节在翻译过程中，mRNA被翻译起始因子eIF4E,eIF4G及PABP包围。eIF4E蛋白与5’端帽子连接，而且eIF4G可加强他们之间的连接，eIF4G是一种大分子蛋白质，同时与eIF4E和PABP发生关联。这种结构保护mRNA的5‘’和3‘’端不受脱帽酶和脱腺苷酶的降解。一旦上述的稳定环状结构被破坏，polyA水解，PABP脱离，紧接着发生脱帽反应。线粒体中的mRNA的降解与真核生物的细胞质中的情形相反

polyA促进降解，是降解的信号。2.无义密码介导的mRNA的降解NonsensemediatedmRNAdecayNMD

突变和剪接错误突变和剪接错误突变和剪接错误突变和剪接错误突变和剪接错误突变和剪接错误发生无义突变和移码突变的mRNA和从核内逃逸的未经剪接还有内含子的mRNAIsitimportant?

Absolutely!为害极大！

NMDprobablyevolvedtoeliminateabnormaltranscriptsduetoroutineerrorsingeneexpression.Forexample,inefficientorinaccuratepre-mRNAsplicingcangenerateanintron-derivedinframenonsensecodon,orashiftinthereadingframeandanexon-derivednonsensecodondownstreamoftheshift.NMD降解过程：当mRNA转运进入细胞质后，立即同核糖体结合并开始翻译，如果存在无义突变密码子则会使翻译提前终止。随着翻译的终止，一组由核糖体部分组分和相关因子组成的物质会继续向下游移动与一段下游元件（DSE）相遇，形成一个异常的核蛋白结构，引起mRNA的5’端水解一个或二个核苷酸残基，完成脱帽反应，脱帽后的mRNA则迅速被5’核酸酶水解。NonsensemediateddecayofmRNAsDAHLBERGJ.E.et.al.RNA2003;9:1-8Copyright2003byRNASocietyNonsensemediateddecayofmRNAsDAHLBERGJ.E.et.al.RNA2003;9:1-8Copyright2003byRNASocietyexonjunctioncomplex(EJC)Nonsense-mediateddecay(NMD).Followingsplicinginthenucleus,theexonjunctioncomplex(EJC),whichcontainsUPF3(acoreproteinoftheNMDpathway),isassociatedwiththetranscript,andtheresultingmessengerribonucleoproteinisexportedtothecytoplasm.Inthecytoplasm,asecondNMDcoreprotein,UPF2,bindstoUPF3.RibosomesassociateandtranslatethemRNA,butarestalledonencounteringaprematureterminationcodon(PTC).ThisresultsinbindingoftheSURFcomplex(comprisingSMG1,UPF1andthepeptide-releasefactorseRF1andeRF3)totheribosome.UPF1alsobindsUPF2,therebylinkingtheEJCtothePTC.PhosphorylationofUPF1bySMG1leadstodissociationofeRF1andeRF3andbindingoftheSMG7adaptorprotein.SubsequentstepsthatarestillbeingelucidatedleadtomRNAdecaybyvariouspathways.b|Non-stopdecay.TranslationofanmRNAthatlacksastopcodonresultsinribosomestraversingthepoly(A)tail,displacingpoly(A)-bindingprotein(PABP)andstallingatthe3'endofthemRNA.Onemodelproposesthat,inyeastandmammaliancells,Ski7,anadaptorproteinthatfunctionsasamolecularmimicoftRNA,bindstotheAsiteonthestalledribosometoreleasethetranscript,andthenrecruitstheexosome.Theexosomedegradesthepoly(A)tailandmRNAbody.InanotherpathwaydescribedinSaccharomyces

cerevisiae,intheabsenceofSki7,thedisplacementofPABPbythetranslatingribosomerendersthemRNAsusceptibletodecappingand5'3'decaybythe5'3'exoribonucleaseXrn1.c|No-godecay.Ribosomescanstallwithintheopenreadingframe(ORF),forexample,onencounteringastrongsecondaryRNAstructure.TheDom34andHbs1proteinsbindthetranscriptnearthestalledribosomeandinitiateanendonucleolyticcleavageeventnearthestallsite.ThisreleasestheribosomeandgeneratestwomRNAfragments,eachwithafreeendexposedforexonucleolyticdecaybytheexosomeandXrn1,respectively.

mRNA编码区3‘’端附近的一个下游元件（DSE)是无义mRNA降解必需的无义密码子与最靠近3‘’端的外显子之间的相对位置决定了无义mRNA是否被降解大于50－55个核苷酸，降解；小于50个核苷酸则不被降解。Garneau

etal.

NatureReviewsMolecularCellBiology

8,113–126(February2007)Nonsense-mediatedmRNAdecay:fromvacuumcleanertoSwissarmyknifeGenomeBiology2004,5:218

VacuumcleanerSwissarmyknife1.国外医学分子生物学分册２５（５）：２６２－２６９７。真核生物细胞中的无义介导mRNA降解机制。2.遗传学报ActaGeneticaSinica,November2004,31(11):1321～1326NMD作用的顺式调控元件3.Nonsense-MediatedmRNADecay:Splicing,TranslationAndmRNPDynamicsLynneE.MaquatNatureReviewsMolecularCellBiology5,89-99(February2004)参考文献3.无终止密码子mRNA降解途径

Thesedatasuggestthatnonstopdecayisinitiatedwhentheribosomereachesthe3’terminusofthemessageRNAScience,2002;295:2258AnmRNASurveillanceMechanismThatEliminatesTranscriptsLackingTerminationCodons.Science,2002;295:2262Exosome-MediatedRecognitionandDegradationofmRNAsLackingaTerminationCodon.4.no-godecay

5.核酸内切酶降解mRNA直接降解核酸内切酶活性受到调节如哺乳动物的RNaseL通常不具活性，但其与2‘’，5‘’磷酸二酯键相连的寡腺苷酸结合时才具有活性，而后者在双链RNA存在时才产生。6.马方综合症

(Marfansyndrome)

马方综合征,是一种常染色体显性遗传的全身性结缔组织疾病,主要累及眼、骨骼和心血管系统,95%的患者死于心血管并发症--主动脉夹层、破裂和充血性心力衰竭。未治患者的平均寿命，男性30岁左右，女性约40岁。婴幼儿患者多因心脏瓣膜病变所致的充血性心力衰竭而夭折。马方综合症是一种结缔组织疾病，所以影响许多结构，包括骨胳、肺、心脏、眼睛和血管。该疾病通常以细长肢为特征。流行病学和发病率

1990年我国的一组流行病学统计报告发病率约为1.72/10,000人，1995年在苏格兰进行的一项人口调查报告MS的最低流行病率为1/14,217(7.03/100,000人)，发病率达1/9802，最近估计的发病率约为1/3-5,000人。

Figure2:PedigreesrepresentinginheritanceofMarfanSyndromeintheSummersfamily.

1896年AntoineBernardMarfan第一次描述了一个叫GabrielleP.的5岁半女孩，并称之为瘦长肢体症(dolichostenomelia)。

1972年Hecht和Beals认为其实该女孩患的是先天性挛缩性蜘蛛指症(CongenitalContractural

Arachnodactyly，CCA，也称作Beals综合征)。马方综合症相关历史名人和报道《三国志》中对天生异相的蜀主刘备的描述是：“身长七尺五寸，垂手下膝，顾自见其耳。”美国总统林肯篮球球星克里斯·帕顿（ChrisPatton）奥运会排球队队员海曼（FloHyman）,死于马方综合征中的主动脉瘤破裂小提琴家帕格尼尼四川排球运动员朱刚、杨怀清喀麦隆球星维维安·福“恐怖大亨”拉登？Healthnote:DoesObamahaveMarfanSyndrome?

PostedonJuly1st,2008byNancyReyes分子遗传学表明符合诊断标准的MFS患者有70－90％发生了致病性FBN1基因突变。FBN1是一种分子量为320kd的糖蛋白，由2871个氨基酸组成，是构成细胞外微纤丝的主要蛋白之一。B.Loeys等通过筛选95个诊断为马方综合征病人FBN1基因的所有65个外显子，发现在93个马方综合征病人中发现了85个FBN1基因突变，频率为91％。鉴定出的突变主要由三类组成：①.41个错义突变；②.13个无义突变和20个移码突变引起的提前终止密码；③.11个突变影响剪接或引起框缺失。如果NMD起作用，则这些突变基因的mRNA降解，不发生马方综合症；否则产生大量的异常蛋白质。7.玉米CMS-S育性恢复机理研究CMS产生的原因CMS的遗传特性rrNrrS×rrSRRN×RrSrrSrSSRRSSrFertileSterileFertileFertileGametophyticCMSSporophyticCMSNowthat~12mtDNAregionsassociatedwithCMShavebeenidentified,itisstrikinghowoftentheeventsinvolveATPsynthasesubunitgenepromoterregionsandportionsofcodingregions(HansonandBentolila,2004,PlantCell,preview).与CMS相关的线粒体片断实验材料S-Mo17rf3rf3

(S)

S-Mo17Rf3Rf3(F)N-Mo17rf3rf3(N)

orf355-orf77的不同拷贝ProbeNSF6625bp4768bp1.8kborf355/BamHIorf355orf771068bp234bp11bp2.8kb和1.6kb转录本的末端位点1583bp2741bp1583bp157bp19bp14bp261bp190bp1068bporf355orf77cox130bp1160bpcox2orf355orf77GCTGGGTTTCTTATGTTAGGAAAAAGAGGGTTCCAAAATCCTTTAAACAAATCCGGCACTTGCTGCGGGAACTTCATTGTGGGCAGTTCCCCACAGAAGATGACCTGGCACTTATCGAGATGTTGTGGACGTATCACCATAGTTCTTAGCTGTCCGTATTGGCGGTTAGTAAGTAGTTTGGTTTCTAGGAGGAAATTGGATTACTTATGAGTTTCTTCGGTGCTAAAGTATACAAGCACATGTCCAATCT

ACATAAAGAT

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AAAGACAGGGCGTCGGCGATCCTCTACTATTAAGAGACAGATAACAATGGTGCCGACAGAGATGGACAGAACTGCAGAGAATACCTCTCCGGAGAAGTCCTTACATGTCTCAAACTAAATAAATCCAACCAATAGTGAAACTGAAACAAAAAACACGTCTCTTACACACGAGAGACACTGTTGAGTCTCTCTATACTATTTTCAGTATAGAGTCGGGGTACACTCAACAAAGAAAAATCCCGAACAAGAA

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