第一章蛋白质化学2

第六节蛋白质的一级结构在不同肽链中：氨基酸的数目、种类、排列顺序不同蛋白质——多肽——肽——AA蛋白质分子量变化范围大；与多肽无严格界线

——通常将6000Da以上的多肽称为蛋白质蛋白质的氨基酸排列顺序——蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构

（primarystructure）一、蛋白质的氨基酸组成

通过酸碱水解可以分析蛋白质的氨基酸组成。二、蛋白质分子结构中的化学键肽键、二硫键、酯键、配位键氢键、疏水作用、范德华力、离子键（一）肽键①肽键中C-N键有部分双键性质

——不能自由旋转②组成肽键原子处于同一平面（肽平面）③键长及键角一定④大多数情况以反式

结构存在三、蛋白质一级结构的测定蛋白质AA顺序测定是蛋白质化学研究的基础1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构样品必需纯（>97%以上）；知道蛋白质的分子量；知道蛋白质由几个亚基组成；测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。1.测定蛋白质的一级结构的要求2.测定步骤(1)多肽链的拆分(2)测定蛋白质分子中多肽链的数目(3)二硫键的断裂(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；(5)分析多肽链的N-末端和C-末端(6)多肽链断裂成多个肽段(7)测定每个肽段的氨基酸顺序(8)确定肽段在多肽链中的次序(9)确定原多肽链中二硫键的位置蛋白质一级结构的测定第七节蛋白质的高级结构一、蛋白质各级结构的基本概念一级结构二级结构三级结构四级结构蛋白质的一级结构

(Primarystructure)肽链中的氨基酸排列顺序。维系一级结构的主要化学键是肽键二、构型与构象构型(configuration)——几何异构和光学异构构象(conformation)——单键的自由旋转产生区别：共价键是否断裂（三）蛋白质的二级结构（SecondaryStructure）指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。只涉及主链构象而不涉及残基侧链维系二级结构的化学键是氢键-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲（一）-螺旋——-螺旋的结构（-helix）又称3.613－螺旋螺距0.54nm每圈含3.6个AA残基

每个AA残基占0.15nm绕轴旋转100°链内形成氢键与轴平行多为右手螺旋R基大小：较大的难形成，如多聚IleR基的电荷性质：不带电荷易形成Pro吡咯环

无法形成链内氢键影响-螺旋形成的因素由两/多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成肽链主链呈锯齿状折叠构象（二）-折叠（

-pleatedsheet）平行肽链间以氢键从侧面连接的构象C总是处于折叠的角上AA的R基团处于折叠的棱角上并与之垂直两个AA之间的轴心距为0.35nm-折叠结构特点:氢键主要在链间/同一肽链不同部分间形成几乎所有肽键都参与链内氢键的交联氢键与链的长轴接近垂直平行式：所有肽链的N-端都在同一边反平行式：相邻两条肽链的方向相反-折叠的类型维持β—折叠片的作用力也是肽键衍生出的氢键β股这种氢键与α-螺旋中氢键有何不同呢？形成氢键的N、O归属于不同的肽链（三）-转角（βturn/bend/hairpinstructure）肽链主链骨架180°的回折结构特点：由4个连续的AA残基组成第一个残基C=O第四个残基NH这类结构主要存在于球状蛋白分子中。形成氢键作用力是氢键

——泛指不能归入明确的二级结构无规卷曲（randomcoil）一、纤维状蛋白质的结构（一）角蛋白（keratin）α-角蛋白：富含胱氨酸β-角蛋白：富含Gly、Ala、Ser大纤维鳞状细胞皮层细胞微纤维微原纤维初原纤维

α螺旋卷发(烫发)的生物化学基础烫发时还原剂（二）丝心蛋白(fibroin)：蚕丝和蜘蛛丝

特点：反平行式β折叠片抗张强度高质地柔软不能拉伸丝蛋白的结构分子中不含-螺旋肽链常由多个六肽单元重复而成

-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-结构胶原蛋白以胶原纤维的形式存在胶原纤维的基本结构单位是原胶原分子三股肽链形成右手螺旋，但每股都是左手螺旋

原胶原分子胶原纤维胶原蛋白

胶原三螺旋只存在于胶原纤维中至今未在球状蛋白质中发现。（三）胶原蛋白Gly四、超二级结构与结构域1、超二级结构

若干相邻的二级结构单元按照一定规律有规则组合在一起、相互作用，形成空间构象上可彼此区别的二级结构组合单位2、结构域二级/超二级结构基础上形成的特定区域相对独立的、在空间上能辨认的三维实体由二级结构组合而成，充当三级结构的构件，其间由单肽链连接维系力有氢键/疏水键/离子键/范德华力五、蛋白质的三级结构(TertiaryStructure)在二级结构基础上包括主链和侧链构象在内的三维结构（主要指球状蛋白）由二级结构元件构建成的总三维结构：一级结构中相距较远的肽段间的相互关系侧链在三维空间中彼此间的相互关系

例如：肌红蛋白肌红蛋白153个AA8段α螺旋

myoglobin，Mb

（三）稳定蛋白质三级结构的作用力氢键范德华力疏水作用离子键配位键二硫键(QuaternaryStructure）六、蛋白质四级结构

指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式。包括各亚基：种类、数目、空间排列方式亚基间的相互作用关系血红蛋白单独亚基无生物功能

亚基血红蛋白血红蛋白四亚基两两相同，α1、α2、β1、β2亚基：蛋白质分子中的最小共价单位。第九节蛋白质结构与功能的关系一、一级结构与功能的关系(一)一级结构决定高级结构核糖核酸酶的变性复性实验

104个AA残基

MW约12.5×103

28个不变残基

进化位置相差愈远，AA序列差别愈大

——用于核对各物种间的分类学关系以及

绘制系统树/进化树

细胞色素C与系统树(二)一级结构与生物进化(三)一级结构变异与分子病血红蛋白分子病

分子病：由于基因突变，导致蛋白质中氨基酸种类发生变化，并引起功能降低或丧失。

镰刀型贫血症（sickle-cellanemia）镰刀状贫血病—血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息正常细胞镰刀形细胞它是最早认识的一种分子病死亡率极高由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构突变正常型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys---β链

谷氨酸镰刀型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys---β链

缬氨酸（极性）（非极性）N第十节蛋白质的重要性质紫外吸收Tyr、Phe、Trp（280nm）蛋白质浓度=1.55A280-0.76A260一、蛋白质的紫外吸收光谱

蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性

pI通常在6.0左右二、蛋白质的两性解离和等电点—与溶剂的性质、离子强度等因素有关分子中含自由氨基、羧基、可解离侧链基团在某一pH值的溶液中,蛋白质分子上所带的正、负电荷数量相等，净电荷为零，在电场中既不移向正极也不移向负极，此时溶液pH值就是该蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最低。

三、蛋白质的胶体性质（colloidalsystem）胶体溶液：分子直径在1-100nm内具有丁达尔效应、布朗运动等性质不能透过半透膜蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.弹性水化膜四、蛋白质的沉淀作用五、蛋白质的变性与复性1、蛋白质变性(denaturation)某些理化因素破坏天然Pr结构状态，引起Pr理化性质改变、生物学功能改变或丧失的现象。

（1）变性的实质次级键被破坏天然结构解体一级结构没有变化（2）变性因素物理：热、紫外线照射、高压和表面张力化学：有机溶剂、脲、胍、酸、碱、重金属阳离子、生物碱等（3）变性蛋白质的特点A.生物活性丧失B.疏水基外露、溶解度降低、粘度增大C.侧链基团暴露:——易与化学试剂反应、光学性质变化D.生化性质改变：结构伸展易被酶解

2、复性（renaturation）——除去变性因素后变性蛋白重新回复到天然结构的现象。六、蛋白质的呈色反应（1）双缩脲反应(BiuretReaction)

紫红/蓝色（所有蛋白）（2）茚三酮反应（5）Folin-酚试剂反应（实验）实验分两步：碱性条件下，蛋白质的肽键与铜结合生产紫红色的蛋白质铜络合物蛋白质铜络合物以及蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸的残基使磷钼酸-磷钨酸还原，产生深蓝色的磷钼蓝和磷钨蓝的混合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正相关。（4）考马斯亮蓝G-250反应(实验）考马斯亮蓝G-250是一种染料，其与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合后，由红色变成蓝色（450nm变成595nm)。第十一节蛋白的分离、纯化与测定一、分离纯化的方法（一）根据分子大小不同的分离方法1、透析和超滤透析（dialysis）血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液加压血液2、密度梯度离心一种蛋白质分子在单位离心场的沉降速度为恒定值，称为：沉降常数/系数（S）用一定的介质（如蔗糖）在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将蛋白质混合液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使蛋白质分层、分离。3、凝胶过滤法测定相对分子质量蛋白质混合样凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量（二）利用溶解度差别的分离方法1、等电点沉淀法（原理？）2、盐溶与盐析3、有机溶剂沉淀盐析法：一般不引起变性加入高浓度中性盐脱去蛋白质的水化层中和蛋白质的电荷Saltingout等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶原因？盐溶—盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（（NH4）2SO4）（三）根据电荷不同的分离方法电泳和离子交换法SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法

蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于：所带电荷分子量分子形状十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键等点聚焦电泳双向电泳（四）蛋白质的选择性吸附——羟基磷灰石（五）亲和层析——根据配体特异性的分离选择题1.在下列有关谷胱甘肽的叙述中,正确的是()

A.谷胱甘肽中含有半胱氨酸

B.谷胱甘肽是体内重要的氧化剂

C.谷胱甘肽谷氨酸的α-羧基是游离的

D.谷胱甘肽的C-端是主要的功能基团2.在有关蛋白质三级结构的描述中,错误的是()A.具有三级结构的多肽链都有生物学活性

B.三级结构是单体蛋白质或亚基的空间结构

C.三级结构的稳定性由次级键维持

D.亲水基团多位于三级结构的表面3.

在有关蛋白质四级结构的描述中,正确的是()A.蛋白质四级结构的稳定性由二硫键维系

B.四级结构是蛋白质保持生物学活性的必要条件

C.蛋白质都有四级结构

D.蛋白质亚基间由非共价键聚合

4.每一种球状蛋白质分子必定具有（）

A.α–螺旋B.-折叠

C.三级结构D.四级结构5.盐析法沉淀蛋白质的原理A.中和电荷，破坏水化膜B.盐与蛋白质结合成不溶性蛋白盐C.调节蛋白质溶液的等电点D.降低蛋白质溶液的介电常数A.B.C.D.

6.右手α-螺旋是一种很稳定的构象，稳定的主要原因（）A螺旋内有芳香氨基酸残基B螺旋内所有肽键的-NH与CO都参与氢键形成C侧链基团从螺旋中向外伸出，不彼此作用D每一个碳碳连键的旋转度都相同7.β-转角中肽链主链出现（）A800B1800C600D1500

填空题1.根据氨