仪器分析-高效液相色谱

第六章

高效液相色谱法化工系徐吉成2011年9月2023/2/61第六章高效液相色谱法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

1906年，俄国生化学家茨维特第一个运用玻璃柱分离植物色素，并取得较好的分离效果，成为世界公认的液相色谱的奠基人。但受当时技术条件的限制，这种经典的柱色谱由于柱效、回收率、重现性等因素的影响，未能迅速发展。高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。-、高效液相色谱的概述2023/2/62高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。

1．高效液相色谱法与经典液相色谱法

高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。

经典LCHPLC柱之内径1~5cm~0.4cm长度50~100cm15~50cm填充材料粒度150µm~200µm4µm~10µm使用压力1~10atm50~200atm分离时间0.5h~天~10min例:分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。2023/2/632．高效液相色谱法与气相色谱法

（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。

(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。

(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。P296从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途2023/2/64总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。1、样品不必气化2、分离温度低3、选择性好4、样品回收容易5、分离效果好塔板数达到104~105/m6、采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器

7、仪器设备费用昂贵，操作严格。3.HPLC的特点2023/2/65广义地讲，除柱色谱外，薄层色谱（液—固色谱）和纸色谱（液—液色谱）也属于LC。狭义的LC指柱色谱。按分离机理，柱色谱法可分为液—固吸附色谱、液—液分配色谱、键合相色谱、离子色谱等。

§6.1HPLC的主要类型及选择2023/2/666.1.1液—固吸附色谱法

液---固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质（如硅胶、氧化铝等），在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。1．分离原理当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂，于是，在固定相表面发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS达平衡时,有其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。2023/2/672.固定相

液---固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。

3.流动相

把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。2023/2/68在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。1.分离原理

液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。6.1.2液---液分配色谱法2.固定相

为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。最常用的强极性固定液β,β′---氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。2023/2/693．流动相

在液液色谱中为了避免固定液的流失，对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱，它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。2023/2/610正相色谱法反相色谱法1.极性固定相

聚乙二醇、氨基与腈基键合相2.相对非极性流动相

正已烷、环已烷

3.极性调节剂

乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷4.分离中等极性和极性较强化合物.

酚类、胺类、羰基类及氨基酸类

5.组分流出顺序

极性小先洗出1.非极性固定相

C18（简称ODS）、C82.极性流动相

水或缓冲液3.极性调节剂

甲醇、乙腈、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物

占整个HPLC应用的80%左右5.组分流出顺序

极性大先洗出

液液分配色谱2023/2/6116.1.3化学键合相色谱法

采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。用来制备键合固定相的载体(基体），几乎都用硅胶。键合相色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。2023/2/612键合在硅胶表面的非极性或弱极性基团具有较强的疏水特性，当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时：3.被分离物极性部分受到极性流动相的作用（或流动相极性减小时），这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并把溶质分子释放而被洗脱下来，促使它离开固定相。

显然，键合固定相对每一种溶质分子缔合和解缔能力的差异，决定了溶质分子在色谱分离过程中的保留值。1、溶质分子进入极性流动相后，即占据流动相中相应的空间，而排挤一部分溶剂分子；2、当溶质分子被流动相推动和固定相接触时，溶质分子的非极性部分(或非极性分子）会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开，直接和非极性固定相上的烷基官能团相结合形成缔合物，构成吸附层，保留在固定相中；2023/2/613

2023/2/6146.1.4凝胶色谱法凝胶色谱又称分子排阻色谱法主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。2023/2/615

以凝胶(gel)为固定相，它类似于分子筛，但凝胶的孔径比分子筛要大得多。凝胶内具有一定大小的孔穴，小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；中等体积的分子部分渗透；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。分离原理

尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。2023/2/6166.1.4亲和色谱法

亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。它通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。2023/2/617离子交换色谱法固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基阳离子交换树脂在表面未端芳环上接上季胺基阴离子交换树脂流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液6.1.6离子交换色谱法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－2023/2/618离子交换色谱法分离原理

树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换而分离。应用

离子交换色谱法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。分析物质有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

离子交换色谱法分离机理2023/2/6196.1.5分离类型的选择

1．根据相对分子质量选择

相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O～2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。

2．根据溶解度选择

弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。

3．根据分子结构选择

用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。2023/2/620色谱类型选择2023/2/621§6.2高效液相色谱仪6.2.1基本构成和工作过程

1.基本构成高效液相色谱仪的结构示意见，一般可分为5个主要部分：高压输液系统、进样器、色谱柱、检测器和工作站（数据处理系统）。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样等。2.工作过程其工作过程如下：高压输液泵将储液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送到分析系统，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测器的信号送至工作站记录、处理和保存，由此得到液相色谱图。2023/2/622高压泵流动相溶剂废液色谱柱进样口检测器2023/2/623

1．高压输液系统

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成，其中高压输液泵是核心部件。6.2.2仪器基本结构

贮液器材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）容积：0.5～2.0L

放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差注意：密封、过滤2023/2/624高压输液泵

要求：泵体材料能耐化学腐蚀；能在高压（30～60MPa）下连续工作；输出流量稳定（±1%），无脉冲，重复性高（±0.5%），而且输出流量范围宽；适用于梯度洗脱。

类型：一般可分为恒压泵和恒流泵两大类恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。2023/2/625梯度洗脱装置梯度洗脱装置——类似于GC中的程序升温。已成为现代高效液相色谱中部缺少的部分。作用是使保留值相差很大的多种组分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离。所谓梯度洗脱，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。它可以分为两种：

低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。高压梯度(或称内梯度系统)：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。2023/2/626梯度洗脱装置低压梯度高压梯度通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱2023/2/627等度洗脱与梯度洗脱2023/2/628梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移分配比变化范围宽的复杂样品应采取梯度洗脱方式分离2023/2/6292．进样系统

高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。

液相色谱进样针：类似于气相色谱进样针，只是其针头为平头，以免扎破六通阀管路。用于可变体积进样2023/2/630六通阀进样器：用于固定体积进样2023/2/6313分离系统——色谱柱

色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。

2023/2/6324．检测系统

在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。1）紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10L。

HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。

在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液2023/2/633两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器(b)(a)2023/2/6342）荧光检测器

许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。灵敏度高，选择性好，可用于梯度洗脱。

2023/2/635紫外吸收检测器(a)可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器氘灯光栅流通池测量光电二极管参比光电二极管二极管阵列检测器2023/2/6363）示差折光检测器原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电转换记录仪放大器遮光板2023/2/6374）电导检测器