毒作用机制及影响因素 4课时

第四章毒作用机制第一节概述毒作用机制的研究内容：①毒物如何进入机体？②怎样与靶分子相互作用？③怎样表现其有害作用？④机体对损害作用的反应等。毒作用机制的研究是评价化学毒物潜在危害的基础。终毒物：终毒物：是可与内源性靶分子（如受体蛋白、酶、微纤维蛋白、DNA及脂质等）相互作用，使机体整体性结构或功能改变，从而导致毒性损害的物质。终毒物形式：母体化合物、母体化学物的代谢产物或者是毒物生物转化期间产生的活性氧，也可能是内源性分子。外源化学物产生损害的途径：最直接途径：化学毒物在机体重要部位出现，而不与靶分子作用。较为复杂途径：毒物进入机体后，抵达靶部位，与靶分子相互作用，引起损害。最复杂途径：a

毒物先分布到靶部位；b终毒物与靶分子相互作用，引起细胞和域结构的紊乱；c启动分子、细胞或组织水平的修复机制，当毒物所致紊乱超过修复能力，修复功能失调，毒作用发生。第二节毒物对生物膜的损害作用一、生物膜概述（一）生物膜的化学组成生物膜膜脂（磷脂、少量的糖脂和胆固醇）蛋白质糖、金属离子、水

脂质双层是所有生物膜的结构基础，而膜蛋白几乎负责生物膜的所有功能。（二）生物膜的结构特点1膜的运动性侧向运动分子的摆动旋转运动翻转运动侧向运动旋转运动2膜脂的相变与流动性相变温度Tc脂质凝固态液晶态（三）生物膜的“流动镶嵌学说”脂质双层是膜的基本结构，膜脂质分子在不断运动中；生理条件下，呈流动的液晶态；脂双层结构既是屏障，也是膜蛋白表现功能的舞台。（三）生物膜的“流动镶嵌学说”细胞膜上的蛋白质与膜脂分子之间存在相互作用，也处于运动之中；部分膜脂分子对于维持膜蛋白的构象和发挥功能有直接的影响。（三）生物膜的“流动镶嵌学说”膜的脂质、膜蛋白和膜糖在脂双层两侧的分布是不对称的，膜上的糖基总是暴露在细胞膜的外表面上。这种不对称性表明了膜功能的复杂性。（四）生物膜的三大基本功能

能量转换；物质运送；信号跨膜转导。二、毒物对生物膜的损害作用（一）对生物膜组成成分的影响化学毒物可引起细胞膜成分含量、结构和性质的改变。①CCl4可引起大鼠肝细胞膜磷脂和胆固醇含量的下降；②SiO2可与人红细胞膜上的蛋白结合，使其结构中的α-螺旋减少；③有机磷农药可抑制突触小体及红细胞膜上乙酰胆碱酯酶的活性。（二）对膜生物物理性质的影响膜生物物理性质：通透性、流动性、膜电荷和膜电位等。

1.对膜通透性的影响许多化学毒物可通过与膜蛋白或膜脂相互作用，改变膜的通透性来发挥毒作用。①DDT可作用于神经轴索膜，改变Na+和K+的通透性，从而产生一系列的神经中毒症状。②缬氨霉素可使线粒体膜对K+的通透性增大，使氧化磷酸化解偶联，从而造成细胞损伤。氧化磷酸化作用：当电子流过呼吸链时，质子通过膜被泵出高[H+]低[H+]线粒体外膜线粒体内膜膜间腔线粒体基质H+Pi+ADPATP＋－＋－＋－＋－＋－线粒体e－ATP酶复合体

（二）对膜生物物理性质的影响2.对膜流动性的影响流动性是生物膜的基本特征之一。现已发现不少化学毒物可以影响膜的流动性。例如，①重金属离子，如Pb2+可引起膜流动性下降；②SiO2可引起巨噬细胞的膜脂流动性升高等。（二）对膜生物物理性质的影响3.对膜电荷的影响膜表面糖脂、糖蛋白形成膜表面极性基团，组成膜表面电荷（如-OH、-COOH、-SO3H，以及His、Arg、Lys、Asp、Glu中的带电基团）。化学毒物对膜电荷性质和密度的改变可能会影响到细胞的功能。第二节毒物对细胞钙稳态的影响一、Ca2+的第二信使作用与细胞钙稳态神经→神经递质体液→

激素→

质膜受体→

胞内中间物质介导第一信使第二信使→生理效应细胞钙稳态（calciumhomeostasis）Ca2+

CaM酶Ca2+，Mg2+-ATP酶肌肉收缩蛋白腺苷酸环化酶磷酸酯酶蛋白激酶离子通道蛋白[Ca2+]=1000μM[Ca2+]=0.1μM细胞“细胞钙稳态”的维持[Ca2+]=1000μM[Ca2+]=0.1μM钙泵Ca2+Ca2+钙通道蛋白质、核苷酸、酸性磷脂内质网线粒体细胞二、毒物对细胞钙稳态的影响及其危害现已发现多种化学毒物可引起细胞内Ca2+浓度不可控制地升高，从而导致细胞损伤或死亡。细胞钙稳态紊乱的主要危害：可抑制线粒体内ATP的合成和使氧自由基的生成增加。可引起微管的解聚，进而损伤细胞的正常形态。可激活一系列水解酶，导致体内蛋白质、磷脂和核酸等的水解。细胞骨架结构：细胞骨架细胞核骨架细胞膜骨架细胞质骨架细胞外基质微丝、微管、中间纤维细胞骨架(Cytoskeleton)引自：丁明孝，等《分子细胞生物学》引自：丁明孝，等《分子细胞生物学》引自：丁明孝，等《分子细胞生物学》钙稳态紊乱的危害—水解损伤：许多膜蛋白是Ca2+激活的中性蛋白酶或钙蛋白酶的靶分子。钙蛋白酶介导的肌动蛋白结合蛋白的水解可引起质膜大疱形成；Ca2+对磷脂酶的激活引起膜的破坏；

Ca2+-Mg2+

依赖的核酸内切酶的激活引起染色质的断裂；

Ca2+浓度升高可封闭拓扑异构酶Ⅱ，使已断裂的DNA无法重新连接。第三节生物分子的氧化损伤一、自由基概述概念：一般指含有一个或多个未配对电子的离子、原子或分子。性质：①具有顺磁性；②化学反应性极强；③生物半减期极短。一、自由基概述类型：①活性氧族（reactiveoxygenspecies,ROS）：

A氧自由基：O2-·、•OH；LO•、LOO•；

B含氧的非自由基衍生物：单线态氧（1O2）、氢过氧化物、次氯酸、过氧化物、内源性脂质和外源化合物的环氧代谢产物。一、自由基概述②其他自由基：碳中心自由基（•CCl3），硫中心自由基（烷硫自由基R-S•），氮中心自由基（苯基二肼自由基C6H5N=N•）；此外，过渡金属离子Cu+/Cu2+、Fe2+/Fe3+、Ti3+/Ti4+可作为自由基反应的催化剂，在自由基的损伤作用中起重要作用。二、氧化应激（Oxidativestress）自由基来源：外源化学物代谢产生；细胞正常生理过程产生。机体抗氧化系统：非酶类抗氧化系统GSH、Vc、VE、VA、尿酸、牛磺酸和次牛磺酸等；酶类抗氧化系统超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶、谷胱甘肽还原酶等。二、氧化应激（Oxidativestress）氧化应激：机体促氧化与抗氧化之间的平衡失调，而倾向于前者，所导致的细胞损伤。“目前多数观点认为外源因素诱导的细胞氧化应激及随后启动信号通路在细胞损伤中发挥重要作用，同时认为氧化应激可同时激活多种信号转导途径和核转录因子，它们之间相互串话，形成了一个复杂而精细的调控网络，共同决定氧化损伤最终引起何种生物学效应”。——曹佳，郑玉新，周宗灿，等.《毒理学研究进展和热点》，中国科学基金，

2011年，第03期

（一）对脂质的过氧化损伤脂质过氧化损伤：在O2存在下，自由基或其活性衍生物引发脂质过氧化及其链式反应。生物膜是生物体内最易发生脂质过氧化的场所。因为它具备脂质过氧化的两个必要条件：氧气和PUFA（polyunsaturatedfattyacid）。膜脂质的结构：X=-OH·

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磷脂酸X=-OCH2CH2N+(CH3)3··

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磷脂酰胆碱X=-OCH2CH2NH3+

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磷脂酰乙醇胺X=-OCH2CHCOO－

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磷脂酰丝氨酸H3N+R1、R2：脂酰基的烃基，R1多为饱和烃基，R2常为不饱和烃基。H2CO–C-R1R2-C-OCHH2CO–P-X甘油磷脂通式OOHOO脂质过氧化反应过程：膜脂质（LH）脂质自由基（L•）O2抽氢作用脂质过氧自由基（LOO•）氢过氧化物（LOOH）脂质氧自由基（LO•）Fe3+Fe2+Fenton反应环过氧化物自由基环内过氧化物自由基丙二醛（MDA）+短链的酮、羧酸或烃类HO•H2O分子内双键加成过氧化作用LHL•单电子氧化还原：凡是能发生单电子氧化还原的金属离子（属于过渡金属）都可与H2O2反应，使其发生裂解，产生自由基，例如Fenton反应：

Fe2++H2O2Fe3++•OH+OH－除Fe2+外，可氧化为较高价态的过渡金属还有铜、钴、钛等离子。LH+L·链启动链扩展脂质（花生四烯酸）过氧化的总过程LHLOOH链终止LOOLO2，水解或热裂＋

其他产物环化作用环内过氧自由基脂质过氧化的其他损害：①脂质过氧化中间产物L·、LOO·、LO·可作为引发剂通过抽氢使蛋白质变成自由基，后者可以引起链式反应，导致蛋白质聚合，使蛋白质的运动和功能受到限制。-CO-NH-C-CO-NH-＋-CO-NH-C-C-NH--CO-NH-C-C-NH--CO-NH-C-CO-NH-R1•R2R1R2自由基蛋白A蛋白BHOOH•交联物脂质过氧化的其他损害：②终产物丙二醛（MDA）可与蛋白质分子中的NH2作用导致多肽链的链内交联或链间交联。此外，醛类产物也能与蛋白质中Cys的-SH反应，使蛋白质失去活性。丙二醛与蛋白质分子的交联：链内交联：CH2C-HC-HOO＋H2NH2NPCH-NHCH=NPCH链间交联：CH2C-HC-HOO＋2P–NH2CH–NH–P1CH=N–P2CH丙二醛蛋白质交联产物脂质的过氧化损伤小结：直接结果是使膜PUFA减少，膜脂流动性降低和膜骨架损伤；过氧化中间产物和终产物引起的膜蛋白共价交联与聚合，影响膜蛋白的构象及其运动性，必然导致膜功能的异常。（二）对蛋白质的氧化损伤对蛋白质的氧化损伤，主要是自由基对氨基酸的作用。例如，所有氨基酸残基均可被∙OH损伤，其中以含硫氨基酸和芳香氨基酸最为敏感。（二）对蛋白质的氧化损伤1.含硫氨基酸的损伤•OH可使甲硫氨酸氧化为甲硫氨酸亚砜；使半胱氨酸（Cys）氧化成Cy-S-S-Cy、Cy-SOH及Cy-SO2H。-NH3+CH3SCH2CH-COO－CH2甲硫氨酸CH3SCH2CH--NH–R2R1-C=OCH2含甲硫氨酸的蛋白质•OHO含甲硫氨酸亚砜的蛋白质CH3SCH2CH--NH–R2CH2R1-C=O聚合（二）对蛋白质的氧化损伤2.芳香族与杂环氨基酸残基的损伤

如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸与组氨酸。经活性氧作用：①Trp的氧化产物为2-、4-、5-、6-或7-羟基色氨酸，甲酰基犬尿氨酸，3-羟基犬尿氨酸或硝基色氨酸。②Tyr转变为3-、4-二羟基苯丙氨酸，二酪氨酸交联产物或3-硝基酪氨酸。③Phe转变为2-、3-或4-羧基苯丙氨酸，2-、3-二羟基苯丙氨酸。④His转变为2-氧组氨酸。（二）对蛋白质的氧化损伤3.脂肪族氨基酸残基的损伤

如，Asp、Glu、Pro、Lys、Arg、Leu、Val与Thr。可能的损伤机制：在α-C原子上除去一个氢原子，形成C中心自由基；其上再加O2，生成过氧基衍生物；后者分解成NH3和α-酮酸，或是NH3、CO2与醛类或羧酸，从而破坏相应氨基酸的结构。（二）对蛋白质的氧化损伤4.肽的折断-NH–CH–CONH–CH–CONH–CH-CR3R1R2-NH–CH–CONH–C•

–CONH–CH-CR3R1R2•OHH2OO2过氧化物肽的折断（二）对蛋白质的氧化损伤5.蛋白质-蛋白质的交联蛋白质之间的交联将形成分子量更大的“分子”，进而限制蛋白质的运动性及其功能。（三）对DNA的氧化损伤1碱基的损伤CCNHNCHHCNNNH2C腺嘌呤CCNHNCHH2N-CHNNOC鸟嘌呤1.对碱基的损伤CCHCNNHC嘧啶CCNHNC-OHH2N-CHNNOC8-羟基鸟嘌呤2.对脱氧核糖的损伤脱氧核糖中的每一个C原子和-OH上的氢都能与∙OH反应；在C位置上抽氢、加氧，而破坏戊糖的结构。3.对DNA链的损伤HCCHHOH2CCCOHOHHOHH脱氧核糖3.对DNA链的损伤DNA链断裂的后果：①可能会造成部分碱基的缺失；②修复的DNA可能存在碱基的错误掺入和错误编码；③也可能引起原癌基因的活化或抑癌基因的失活等，从而导致细胞的突变或癌变。（四）对多糖的氧化损伤ROS中活性很强的自由基如•OH可无选择地攻击糖类，抽提氢，使其变为碳中心自由基，后者与O2结合成为过氧化物，然后裂解。第四节化学毒物与生物大分子的共价结合一、概述概念：共价结合是指化学毒物或其活性代谢产物与机体内一些重要的生物大分子如核酸、蛋白质等发生共价结合，从而改变这些生物大分子结构或功能的过程。一、概述方式：一般为亲电子剂与大分子的亲核基团作用，同过共价键形成稳定的复合物——加合物，使外源化学物或其代谢产物进入大分子内而成为其中的组成成分，一般用生化或化学手段处理不能使其解离。特点：永久性、不可逆地改变内源性物质的结构。二、与蛋白质的共价结合蛋白质分子中可与外源化学物共价结合的功能基团：①氨基和羧基；②Ser和Thr的羟基；③Cys的巯基；④Arg的胍基；⑤His的咪唑基；⑥Tyr的酚羟基；⑦Trp的吲哚基。1.与白蛋白的共价结合白蛋白是血液和组织间质中的主要蛋白质，也是血液中重要的运输载体。血清白蛋白由肝细胞合成，而肝脏正是外源化学物活化代谢的主要场所，因而白蛋白更易受到由肝细胞活化形成的亲电子剂的攻击。2.与血红蛋白的共价结合外源化学物进入血液后，先与红细胞膜结合，继而进入细胞与血红蛋白共价结合。血红蛋白中参与结合的基团主要有氨基、巯基和芳香胺基团。应用：血红蛋白加合物可用于人群接触外源化学物的监测，具有样品容易获得，寿命长的优点，方便检测。3.与组织细胞蛋白质的共价结合与膜蛋白或胞浆蛋白共价结合，将影响到细胞的正常代谢或信号传递过程；而与核蛋白的共价结合将对细胞生长、增殖和分化等的调控产生影响。

核蛋白（nuclearprotein）是指在细胞质内合成，然后运输到核内起作用的一类蛋白质。三、与核酸的共价结合毒物类型：亲电性代谢产物为主，亲核性代谢产物和自由基也可。结合部位：碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸均可，但以碱基损伤的毒理学意义最大。结合后果：细胞突变、癌变及其他一些细胞损伤。应用：一般，DNA加合物一旦形成，致癌过程即已启动。因此，DNA加合物是一类重要的生物标志物，可用于化学物致癌的早期检测。四、共价结合的毒理学意义：①加合物是一类重要的生物标志物，可用于反映机体对毒物的接触、损伤程度；②有助于毒性损伤的早期诊断和防治；③可用于解释某些化学毒物的中毒作用机制。第五章影响毒性作用的因素第一节毒物因素一、化学结构1.同系物的碳原子数脂肪烃类的毒性主要为麻醉作用。一般随碳原子数增多，毒性增强；但达到9个碳原子以后，碳原子数增多，毒性作用反而减弱。2.饱和度碳原子数相同时，不饱和键增加，毒性增强。一、化学结构3.构型碳原子数相同，一般，毒性：直链>支链，成环>开环。多取代基：分子对称的>不对称的；如，带两个取代基的苯环化合物的毒性：对位>邻位>间位。立体构型：一般，受体或酶只能与一种旋光异构体结合而产生生物效应，故同一化学物的不同旋光异构体的毒性不同。一般L型有生物活性，D型则反之。同分异构体的毒性差异：有机氯农药六六六，有7种同分异构体，常用的有α、β、γ和δ等。

γ、δ-六六六急性毒性强；

β-六六六慢性毒性大；

α、γ-六六六对中枢神经系统有很强的兴奋作用；β、δ-六六六则对中枢神经系统有抑制作用。一、化学结构4.烃基取代非烃类物质中引入烃基，脂溶性增高，易于透过生物膜，毒性将增强。此外，烃基也能增加毒物的空间位阻，而影响其毒性。如，乙酰胆碱在体内易被水解，作用时间较短；但乙酰甲基胆碱水解缓慢，作用也较持久。一、化学结构5.卤素取代卤素具有强吸电子能力，结构中引入卤素，化学物极性将增强，更易与酶结合，使毒性增高。例如，肝毒性：CCl4>CHCl3>CH2Cl2>CH3Cl>CH4。一、化学结构6.羟基芳香族化合物引入羟基，极性增强，毒性增加。如，苯→苯酚。多羟基芳香族化合物毒性更高。脂肪烃引入羟基后，麻醉作用增强，并可损伤肝脏。一、化学结构7.巯基-SH的极性弱于-OH，因此硫醇的脂溶性较高，更易渗入组织；可干扰蛋白质中半胱氨酸和胱氨酸之间的氧化还原作用的平衡。故-SH引入化合物其毒性增强。一、化学结构8.酸基与酯基酸基（如-COOH、-SO3H）引入分子，电离度和水溶性增高，脂溶性降低，难以吸收，毒性降低。酸基酯化后，脂溶性将增高，毒性增大。9.氨基胺具有碱性，易与核酸、蛋白质的酸性基团反应。-NH2引入，毒性将增强。二、物理性质1.溶解性脂溶性高的化学物易通过脂质双分子层，易在脂肪组织中蓄积，易侵犯神经系统。但是，脂溶性极高的化学物不利于经体液转运。水溶性高的化合物不易通过生物膜而吸收，较易随尿排出体外。二、物理性质2.挥发性常温下挥发性大的液态化学物易形成较大的蒸气压，易于经呼吸道吸入。拌饲染毒时应注意，挥发性的化学物加入饲料后可因挥发而减少接触剂量。二、物理性质3.分散度物质颗粒越小，分散度越大。经口摄入的固态化学物质，其分散度可影响经消化道的吸收率，进而影响其毒性。三、化学物的稳定性和不纯物毒物在使用情况下的“不稳定性”可影响其毒性。当待评价化学物不是纯品时，须注意其杂质的性质。四、毒物进入机体的途径1.接