营养与代谢的实验室监测

营养与代谢的实验室监测刘放南氨基酸分析一、氨基酸在体内的动态分布食物蛋白质肌肉蛋白质上皮或实质细胞中蛋白质结缔组织中蛋白质血浆蛋白质血红蛋白、白细胞中蛋白质内源性蛋白质组织或血液蛋白质氨基酸合成组织氨基酸生理活性物质活性肽生物胺核苷酸和核酸氨基酸吸收血中氨基酸氨基酸分解供能排泄粪氮皮肤、尿尿素、氨二、氨基酸在体内的分布比例血液5％肌肉70％组织25％三、氨基酸的分类根据体内合成情况分为：必需氨基酸IleuLeuLysMetPheThrTry

Val非必需氨基酸AlaAryAspCySHGluGlnGlyHisProSerTyrOrn半必需氨基酸ArgOrn根据化学结构分为:脂肪族氨基酸：一氨基一羧基酸GlyAlaValLeuIleuSerThrCySHMet一氨基二羧基酸及其衍生物AspAsnGluGln二氨基一羧基酸ArgLys芳香族氨基酸：PheTyr杂环氨基酸：HisTry四、氨基酸测定的意义（1）用于监测营养支持的病人验证不同氨基酸制剂的效果平衡氨基酸高支链氨基酸个体化氨基酸的监测了解个体的氨基酸组成是否合理(2)用于诊断疾病

尿3-MH：判断机体内分解代谢与合成代谢的状况。如下降反应肌肉分解的减少，机体的合成代谢多于分解代谢，营养支持获得了效果。如上升说明分解代谢高于合成代谢，应激程度仍重或营养支持未能获得应有的效果。BCAA/AAA：正常值—3.0~3.5肝硬化、肝炎等肝脏功能有障碍时，苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸不能被利用，芳香族氨基酸在体内积蓄，支链氨基酸因在肝外被氧化供能而量减少。BCAA/AAA下降，过多的AAA进入脑内产生假性神经递质，影响脑神经的功能，出现昏迷，应补充高BCAA的氨基酸液。严重感染时，血清重BCAA/AAA下降的机理亦为BCAA在肝外被利用，Phe、Tyr因肝功能障碍不能被代谢。诊断对某一氨基酸代谢有先天性缺陷如苯丙酮尿、高苯丙氨酸血症、高胱氨酸尿症、色氨酸血症、高甘氨酸血症等，病症属少见，但诊断的确定需依赖血清或尿中的氨基酸谱分析。肝豆状核变性：铜的代谢障碍，肾脏也受到损害出现氨基酸尿，Thr、Tyr、Ala、Gln的排出量增加，血清铜值是主要诊断依据，尿氨基酸分析可以佐证。（3）用于指导治疗氨基酸是组成机体蛋白质的基本物质外，它们还具有药理学作用。

精氨酸－－解除氨毒，能促进分泌胰岛素、胰高血糖素、生长激素、胃泌素与生长激素的作用，可以促进胸腺的生长，增加免疫能力以及活化吞噬细胞。

天门冬氨酸－－降低血氨，治疗心肺综合症、急慢性肝炎并有高氨血症，治疗高胆脂血症，也是吗啡的拮抗剂。谷氨酸－－降低血氨，有抗纤维化的作用，可用于治疗矽肺与石棉肺。谷氨酰胺－－是小肠特需的氨基酸，不足将引起肠粘膜萎缩，绒毛变细变短，应重视增加此氨基酸。

组氨酸－－可用于治疗消化性溃疡，类风湿性关节炎与结核病，它是组成血红蛋白的必要成份，缺乏时导致贫血。

苯丙氨酸－－抗忧郁与抗炎的作用

色氨酸－－能控制精神分裂症、癫痫、抽搐等症状。

酪氨酸－－为儿茶酚胺的前体，亦有抗忧郁的作用。（4）用于鉴别组织机体的每一种组织都由一定的氨基酸组成，在鉴别新生或合成的组织性质时，除细胞学鉴定方法外，还可以分析其氨基酸成分，如人工合成的牛胰岛素，经氨基酸分析后，其含量与自然牛胰岛素一样。骨科手术治疗中，有以自体骨膜修补关节面的方法，其后能形成软骨样组织，可经氨基酸分析，证实其组成是否与自体的软骨一样。氨基酸测定的方法生化检验法根据氨基酸的呈色反应

色谱法薄层层析、纸层析液相色谱离子交换法反相分配法高效液相色谱法的特点高压：供液压力和进样压力很高高速：分离分析的速度快高效：高效固定相、流动相选择性广高灵敏度：采用了灵敏度较高能连续测定样品组分的检测器流出相分容易收集：可以很容易地按照记录纸上出现地峰用收集器来收集洗脱出来地组分流动相流动相进样器检测器工作站高压泵高压泵高效液相色谱仪示意图氨基酸的呈色反应氨基酸显色用试剂和条件呈现色精氨酸-萘酚和次亚氯酸钠（坂口氏反应）红色胱氨酸、半胱氨酸亚硝基铁氰化钾、氰化钠，在稀氨水中红色半胱氨酸1，2-萘醌-4-磺酸钠和次亚硫酸钠红色组氨酸、酪氨酸重氮苯磺酸，在碱性溶液中红色色氨酸乙醛酸，在36N硫酸中紫色对二甲氨基苯甲醛，在12N盐酸中蓝色酪氨酸磷钼钨酸蓝色Millon反应，与硝酸汞在硝酸中加热红色酪、色、苯丙氨酸浓硝酸中加热（黄蛋白反应）黄（碱化后转红）甘氨酸邻苯二甲醛溶液绿色甲硫氨酸1％高锰酸钾2％碳酸钠黄色脯氨酸、羟脯氨酸茚三酮黄色、橙黄靛红天蓝桂皮醛浅褐紫

各种氨基酸测定方法的比较分析方法柱后衍生柱前衍生离子交换法茚三酮离子交换法OPA反相分配法OPA反相分配法PITC反相分配法DABS分析时间80分80分30分15分30分灵敏度通常分析检测极限1nmol100pmols1nmol50pmols500pmols10pmols100pmols1pmol300pmols5pmols检测1级、2级胺可见光：570nm440nm1级、2级胺荧光：EX：338nmEM：425nm1级胺荧光：EX：338nmEM：425nm1级、2级胺紫外光：254nm1级、2级胺可见光：455nm重现性（BT）0.2%0.2%2%2%0.5%分析精度C.V.%1-2%(1-2nmol)3-5%(1-2nmol)5-10%(50pmol)5-10%(100pmol)2-5%(200pmol)分析装置HPLC+其他装置离子交换柱柱后衍生器离子交换柱柱后衍生器ODSC18柱ODSC18柱ODSC18柱

氨基酸正常值（mol/L）磺基丙氨酸121±14异亮氨酸65±14牛磺酸130±20亮氨酸131±29门冬氨酸35±5酪氨酸57±14苏氨酸109±26苯丙氨酸89±20丝氨酸114±20-氨基丁酸75±22谷氨酸96±17组氨酸102±20谷氨酰胺659±100色氨酸92±26脯氨酸142±48鸟氨酸191±34甘氨酸287±49赖氨酸236±39丙氨酸316±16精氨酸95±21胱氨酸53±17缬氨酸187±42蛋氨酸27±7氨基酸测定时注意事项好的氨基酸分析要达到：痕量分析－－在pmol水平简化样品的制备过程检测出所有的氨基酸快速色谱过程稳定的衍生物线性的相应氨基酸分析实验注意A.流动相的配制：稳定性、纯净、严格的pHB.样品的预处理肠内营养：水解血样：沉淀法、超滤组织：匀浆、小预柱C.分析柱的平衡、清洗和储存收集和储存样品血样－－及时分离出血清组织－－存放在液氮中3-MH的测定意义及方法意义：观察蛋白质的分解状态原理：PICO-TAG氨基酸分析法，采用异硫氰酸苯酯（PICO）试剂作为柱前衍生剂，衍生反应：方法：配制缓冲液：A缓冲液B缓冲液衍生试剂样品稀释液尿样处理：Sep-pakC18小柱处理衍生反应：三次冷冻干燥色谱条件及梯度程序：UV:254柱温：46℃流速1ml/minGln测定的意义在营养液中加用谷氨酰胺可逆转分解导致的不良作用总体上降低骨骼肌氨基酸的流出；防止肠粘膜萎缩，防止菌群易位；增强免疫功能。方法：配制试剂流动相A流动相B衍生试剂样品预处理及衍生：血、肌肉和肠粘膜色谱条件：色谱柱：-BondapakC18250nm4.6nm10m柱温：20℃UV:340nm梯度洗脱时间（分）缓冲液A（％）缓冲液B（％）流速（ml/分）0.0083171.23.0062381.23.2060401.212.0060401.214.0083171.218.0083171.2精密度实验：变异系数4.21%回收率：96.757.89%最低检测限：40nmol/L正常值：男688.906106.15女630.71499.32p<0.05羟脯氨酸测定意义和方法意义羟脯氨酸（Hpro）为前胶原、胶原蛋白合成必需的前体氨基酸，外科腹腔感染病人肉芽组织中Hpro含量均明显下降，而导致局部前胶原及胶原蛋白合成抑制，影响了组织愈合能力。有研究表明，临床感染病人使用了生长激素（GrowthHormone）后可提高肉芽组织中Hpro的含量，促进组织生长愈合。外科腹腔感染病人使用生长激素时，常检测肉芽组织内Hpro的含量，以调整生长激素的用药量。方法

样品处理：从液氮罐中取出肉芽组织，称取100mg左右置碾钵中，倒入液氮，待组织冷冻干燥坚硬后进行碾磨，粉碎后再加入液氮碾磨，如此反复3次。加0.2ml样品稀释液后超滤，取滤液10l注入0.5cm5cm的玻璃样品小管中，衍生干燥后进样。试剂：A缓冲液：三水醋酸钠、水、乙晴、少量的EDTAB缓冲液：乙腈、水、甲醇衍生剂：异硫氰酸苯酯（PITC）色谱条件分析梯度表时间（min）A%B%初始10006.010007.0010011.0010012.0100032.01000氮平衡测定的意义氮平衡－－机体每日摄入氮量与排出氮量的得失总结可动态地反映蛋白质和能量的平衡状态测定方法：1尿尿素氮的测定：硫胺脲法操作方法试剂标准（ml）测定（ml）尿素氮标准液0.5尿稀释液0.5DAM-TSC液0.50.5酸混和液4.04.0注意：尿放防腐剂；煮沸时间准确；浓度过大应稀释计算：尿中尿素氮g/24h尿＝测定管/标准管224h尿量（L）氮排泄量＝尿尿素氮＋4g（皮肤0.5g，粪便1-1.5g，氨素，尿中未测定的蛋白质分解终产物2g）2净氮：微量凯氏定氮法：

操作方法：消化、蒸馏、滴定

例肠移植病人氮平衡用药后（天）12345灌注氮（g）9.69.69.69.69.624h粪定氮（g）3.82.11.91.62.124h尿定氮（g）10.97.39.19.18.1氮平衡-5.110.2-1.4-1.1-0.6微量蛋白的测定

前白蛋白、纤维连接蛋白、转铁蛋白及C-反应蛋白、2-巨球蛋白

测定方法：单向免疫扩散法－－抗原定量方法

原理：抗原和抗体反应后在琼脂凝胶上形成沉淀环，根据抗原的含量和沉淀圈的直径成比例关系来进行抗原的定量。操作：以生理盐水配制0.06MpH8.6的巴比妥缓冲液1、2％琼脂糖，每管4ml分装2、0.1ml抗血清＋3.9ml生理盐水与4ml2％琼脂糖混合浇板3、样品稀释：0.1ml血清＋0.9ml蒸馏水4、加样：免疫扩散板上打孔，取稀释血清10l点样5、24h37℃孵育后测定沉淀圈直径6、根据不同稀释度的参考血清做出的标准曲线根据回归方程lgy=ax+b,换算出沉淀圈在4.0~15.0mm之间对应的蛋白含量，同时乘以标本稀释系数。正常值参考范围：男女转铁蛋白（mg/L）2524±3992739±520前白蛋白（mg/L）300±60230±30纤维连接蛋白（mg/L）231±46维生素C测定的意义和方法意义

维生素C（抗坏血酸，Ascorbicacid）人体重要的营养物质，也是机体主要的抗氧化屏障，能改善机体的免疫功能，并参与氨基酸的代谢，在严重创伤、感染、多器官功能障碍、再灌注损伤等方面具有一定的辅助治疗作用。方法样品处理静脉血2ml离心0.4ml血浆去蛋白肝素抗凝进样10l滤液色谱条件色谱柱：YWG-NH24.6mm200mm10um检测器：UV256nm流动相：9.0/91.0(甲醇/水)＋pH3.05mmol/LH3PO4缓冲溶液流速1.0ml/min注意事项血浆中维生素C极易氧化降解，因而采集标本后应立即检测，如需保存样品应加入等量维生素C保护液（0.35mol/L高氯酸＋0.27mmol/L乙二胺四乙酸钠＋0.1%二硫苏糖醇）血内维生素E的检测维生素E的功能1、通过阻碍胆固醇升高来防止动脉阻塞，是一种强大的反凝结物质。2、减缓所有细胞和组织的衰老。3、保护身体免受环境污染物的损害。4、保护红血球健康，并防止贫血。5、改善大多数皮肤病。6、帮助伤口更快地愈合。样品制备：200µL血清＋400µL（乙腈：无水乙醇50：50混和液），涡旋混合，取上清夜，再加入400µL正己烷混和移取正己烷层，氮气吹干。进样时加入流动相200µL溶解。色谱条件：色谱柱：XTerraRP18(3.9mm×150mm×5µm)柱温：30℃流动相：甲醇：水（92：8v/v）流速：1ml/min检测波长：292nm进样量：20µL维生素E标准品色谱图血清样品色谱图维生素EB族维生素检测B1、B6、B1224例正常人血液标本20例克隆氏病人血液标本均有明显差异临床：克隆氏病人用药后是否能提高，等待样品乳果糖/甘露醇排出率的测定

意义和方法意义：这两种糖不被机体代谢，口服后以原形从尿中排泄，尿中的排出量可反映肠道的吸收量。目前认为它们通过肠粘膜的途径主要取决于其分子的体积。甘露醇是单糖（分子量182），分子较小，主要通过肠粘膜细胞膜上的水溶性微孔透过肠粘膜。乳果糖是双糖（分子量342）分子较大，主要通过肠粘膜细胞间的紧密连接透过肠粘膜，这也是细菌及其毒素通过肠粘膜的途径。在疾病状态下，肠粘膜可能萎缩，吸收面积减少，甘露醇通过减少。同时，因肠粘膜细胞间的紧密连接受到破坏，乳果糖通过增加。这样可使乳果糖/甘露醇排出率比值增加，这是临床评估肠粘膜完整性和诊断肠粘膜屏障功能的方法。方法

仪器Waters高效液相色谱系统检测：示差折光检测仪，加热温度37℃，灵敏度32流动相：乙腈/水72：28色谱柱：AltimaAmino5um250mm4.6mm柱温：32℃尿处理:尿样离心10min，取上清0.4ml超滤去蛋白取滤液＋100mg阴阳离子交换树脂，充分振荡，离心取上清，过0.5um膜。GC测定游离脂肪酸仪器：HP-4890D气相色谱仪FID检测器HP-3398色谱工作站色谱条件：

色谱柱：HP30m0.32mm0.25μm石英毛细管柱，柱箱梯度升温155℃～200℃，检测器温度250℃，进样器温度230℃，载气（N2）流速为20ml/min。血标本预处理0.5ml血清＋10ml内标溶液＋2ml三氯甲烷/异丙醇（9：1％）＋2MHCl30μl，振荡、离心，取下层1ml吹干＋BF3-2/甲醇（1：3）0.5ml,70℃反应10min，冷却，＋0.5ml水1.5ml正己烷，振荡、离心，取上层液1ml，吹干。进样时以正己烷溶解，进样1-2μl。游离脂肪酸C6:0C8:0C10:0C12:0C14:0C16:0C18:0C20:0C22:0C24:0短链脂肪酸短链脂肪酸是指含碳2－4个的直链或支链脂肪酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸。短链脂肪酸是肠道上皮的特殊营养因子：维护全肠道上皮细胞的完整性和杯状细胞的分泌功能。对粘膜免疫细胞有维护作用。于结肠中产生并分解结肠中的益生菌。样品制备：超滤，截留10000分子量的物质（去除蛋白）色谱条件：色谱柱µBondparkC184.6×250mm柱温35℃流动相A液pH2.35的磷酸缓冲液B液甲醇D-木糖的测定

测定的意义D-木糖吸收实验能良好地反应小肠吸收功能，