抗原标记蛋白分离线粒体方法的比较

抗原标记蛋白分离线粒体方法的比较前言（Abstract）:线粒体是细胞的“powerhouse”，为提供细胞新陈代谢的能量的细胞器；此外，线粒体有自身的DNA和遗传物质，因基因组数量有限而成为一种具有半自主性的细胞器。因此线粒体的存在对细胞具有重要的意义。时下某些与线粒体有关疾病的发生或发生某种疾病时线粒体的变化，对于研究这类疾病（如癌症等）以及如何治疗这种疾病都有相关的医学价值。随着对线粒体的研究深入，分离得到线粒体的纯度在其本身的研究中愈显重要。迄今，分离线粒体的方法不胜枚举，如电泳，离心等，但分离得到的线粒体的纯度不尽相同。要想得到高纯度度线粒体，能将线粒体从细胞内一个一个“拿”下来是最好不过的。我们的问题在于谁去拿呢？在这种情况下，抗原抗体结合的特异性为我们打开了很好的一扇门。这里所提出的方法基于抗原抗体（Ag-Ab）反应的专一性，可以特异性的相互结合。根据这一原理，如果在线粒体膜上特定的蛋白，用相关的抗原进行标记，在分离的过程中通过相应的抗体则可以将线粒体完全的分离开来，这样就可以分离得到高纯度的线粒体。主体：线粒体膜蛋白（Theproteinsofmitochondrialmembrane）:线粒体是双层膜的细胞器。根据结构与功能的关系，功能越是多的结构其组成越是复杂，主要表现在蛋白质的数量和种类上。线粒体无时无刻不在提供细胞生理活动所需的能量，它对细胞的重要性这边就不再赘述。也就是说线粒体双层膜上含有丰富的蛋白质，如腺苷酸转运蛋白、棕色脂肪组织的解偶联蛋白、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、TOM-22以及D-3羟丁酸脱氢酶等。这篇文章的主要目的在于运用抗原标记抗体识别的技术对几种蛋白标记分离线粒体的方法的比较。一、TOM-22&Anti-TOM22[2]：1、TOM-22蛋白是存在于线粒体外膜上转位酶的三个亚单位之一（成分为：TOM40、TOM7、TOM22），在真菌和真核生物的线粒体转位酶内所起到的作用是益是弊现在还没有个定论。其抗体为Anti-TOM22。2、分离过程：取样。人或任何真核生物体组织细胞都可以作为线粒体的来源。根据线粒体分布差异，取线粒体较多的组织块。II.组织细胞的溶解:获取不同人细胞系大约融合90%并用PBS洗涤两次，1X10八7在1ml的用冰预冷的PBS溶液中，溶液中含有完备的蛋白抑制混合片剂并被一根针剪切大约20次。考虑到细胞的不同大小，不同直径的针用于细胞的碎裂：26G用于293人胚肾细胞，29G用于Hela细胞，27G用于骨肉瘤细胞的破裂。玻璃匀浆机用于碎裂大量的细胞。取洗涤液一等分溶液，通过锥虫蓝排斥反应来确定80%的细胞已经溶解。［2］III.分离过程：1、 凝胶柱的分离：将抗体anti-TOM22加到充满凝胶颗粒的层析柱中,取先前的细胞溶解液，分次等量的通过凝胶柱。由于抗原抗体反应的特异性，含有TOM22蛋白的线粒体则、被吸附在凝胶颗粒中，由此将线粒体从混合溶液中分离开来。吸附在凝胶上的线粒体与抗体结合，用PH低于TOM22等电点的盐酸溶液多次清洗凝胶柱，破坏其抗原抗体之间的作用力，使得二者分开，即可得到高纯度的线粒体。2、 超顺磁珠分离（superparamagneticmicrobeads）1）、超顺磁珠：anti-TOM22microbeads。磁珠是极其小的（直径为50纳米）超磁力微粒物的胶体悬浮液。［2］通过抗原抗体结合在线粒体的外膜上，按照上述方法组织细胞溶解后，将溶解液放在一个强磁场中，根据磁场中的作用力进行分离。3、 方法可行性的分析一、凝胶柱分离：凝胶柱分离是一种较为普遍的分离方式，主要利用分子量的大小来进行分离。通过抗原抗体反应加强了凝胶对特定物质的吸附性。经过数次的过滤后，通过改变反应的PH值，即如上所说的用PH低于TOM22的等电点的盐酸清洗凝胶柱，从而破坏其抗原抗体之间的作用力。但这种方法由于分离抗原抗体是其他杂质的引入，使得分离出来的线粒体的纯度受到干扰。

二、超顺磁珠的分离：（MACS）1）、产出率为了确定这种方法能够成功的分离出线粒体，取一个人胚肾293报道分子细胞系持续不断的表达EGFP（绿色荧光蛋白）与来自于细胞色素C氧化酶的亚基伽的前体的线粒体定向序列相互融合，结果可见如图［1］：Fig.1.FACSanalysisofmitochondriaisolatedfromtransfected293HEKcellsusingtheMACSprotocol.Mitochondriaintransfected293HEKcellsexpressEGFPfusedtoamitochondrialtargetingsequenceand,therefore,arefluorescentlylabeled.Thegreenlinedisplaysthespecificfluorescenceofmitochondria,whereasthegrayarearepresentstheautofluorescenceofmitochondriafromuntransfected293HEKcells.Comparedwiththecrudecelllysatebeforeisolation(A),themitochondrialfraction(C)showsasignificantenrichmentofmitochondria,whereashardlyanysignalwasdetectableintheflow-throughandwashfractions(B).Anoverlayofthecrudecelllysateandmitochondrialfraction(D)confirmsthespecificenrichmentofmitochondriaobtainedwiththeMACSprotocol.

2）、线粒体的富集蛋白印迹分析［1］显示出线粒体蛋白的数目，比如内膜上的细胞色素c氧化酶，外膜的TOM22，线粒体核蛋白TFAM，和细胞色素c通过MACS分离得到的线粒体碎片显著增多。表明在被洗涤出来的碎裂片线粒体有着的富集。［2］COXITOM22Gdgin97TFAMCytCP-aobnRab4Fig.2.(A)Enrichmentofmitochondria.TheamountsofsubunitIofcomplexIV(COXI),22-kDatranslocaseofoutermitochondrialmembrane(TOM22),mitochondrialtranscriptionfactorTFAM(TFAM),andcytochromecCOXITOM22Gdgin97TFAMCytCP-aobnRab4Fig.2.(A)Enrichmentofmitochondria.TheamountsofsubunitIofcomplexIV(COXI),22-kDatranslocaseofoutermitochondrialmembrane(TOM22),mitochondrialtranscriptionfactorTFAM(TFAM),andcytochromec(Cytc)inwholecelllysatewerecomparedwithequalamountsofproteinfromthemitochondrialfractionisolatedfromHeLacellsusingtheMACSprotocol.(B)Theamountsof-&ctin,GAPDH,Rab4,andGolgin-97,representingproteinsfromcytoskeleton,cytosol,Golgiapparatus,andendosome,respectively,inwholecelllysatewerecomparedwiththeequalproteinamountsfromthemitochondrialfractionisolatedfromHeLacellsusingtheMACSprotocol.(C)AmountsofCOXI(mitochondria),KDEL(endoplasmicreticulum),andlaminsAandC(nucleus)inthemitochondrialfractionsobtainedusingDC,theMACSapproach,andUC.、线粒体的纯度MACS分离得到的线粒体会有来自内质网、核内体、高尔基复合体、胞核和胞液。运用蛋白免疫印记分析，以这些污染物中某些蛋白质为抗原，利用相对应的抗体如B-Actin,GAPDH,Golgin-97andRab4，能分别识别并结合细胞骨架、胞液、高尔基复合体和胞内体，从而出去相关的污染物。分别的与通过DC的方法分离的到的线粒体相比。［5］通过UC分离得到的线粒体含有相近数量的来自线粒体和核内的污染物。［7］因此，相对来说MACS分离线粒体的方法是相对较为理想的。二、D-3羟丁酸脱氢酶（BDH）：D-3羟丁酸脱氢酶（结构如上图：［18］）是位于线粒体内膜上的膜结合酶。［8］其活性中心主要位于基体的旁边催化线粒体的新陈代谢，产生两种重要的代谢产物:3-羟基酸丁盐和乙酰乙酸。［5］此外它还是一种依赖NAD阳离子的酶。通过绿铜假单疱菌可以获得D-3羟丁酸脱氢酶的抗体，借此可以特异性的识别结合D-3羟丁酸脱氢酶，分离线粒体。I、 材料的准备：因依赖DNA阳离子的D-3羟丁酸脱氢酶可以可逆性的将D-3羟基酸丁盐转化为乙酰乙酸，在线粒体氧化还原反应和能量代谢中起到关键性的作用。选用Jerboa作为实验的动物。［5］Jerboa是一种夜行的是啮齿类动物，主要生活在摩洛哥高地上。其具有惊人的耐高温，耐寒，耐干燥的特征，是一份很好的实验材料。BDH多克隆抗体的制备：多克隆抗体anti-BDH可以通过从原核生物铜绿假单胞菌体内的BDH通过相关的技术如利用家兔或其他一些手段等制备相关抗体。在温度为35°C，PH为4~10之间时,BDH与其抗体能够很稳定的结合，而在大于50°C或者在17C时，抗原抗体之间的相互作用力会变小或者消失，从而导致抗原抗体的分离，使获得纯化的目标物质。II、 分离：BDH可以通过antigen-antibody反应来进行分离提纯，则说明，D-3氢丁酸脱氢酶可以被相应的抗原识别，进而在分离出线粒体。BDH通过从铜绿假单胞菌中分离提纯出相应的多克隆抗体。［5］然后在取Jerboa肝脏的细胞，通除垢剂（cholate或者TritonX-100）或者通过磷脂酶A2产生的溶血磷酯素类来使细胞膜增溶从而破裂。在洗涤数次（如利用TOM22中所提到的方法）后，取一等分洗涤液，在35C，PH4~10的条件下，通过装有anti-D-3羟丁酸脱氢酶的凝胶柱中，则因含有D-3羟丁酸脱氢酶的线粒体被吸附在凝胶柱，其他的细胞器则因重力作用流出凝胶柱。洗涤数次后，调节温度至17C或50C以上，就可以将anti-BDH与BDH分开，在用蒸馏水洗涤2~3次，从而得到纯净的线粒体溶液。

m、样品的回收：凝胶中吸附了大量的线粒体，通过改变温度来使抗原抗体进行分离，并用蒸馏水进行洗涤，因而这种方法收集得到的线粒体不含有其他的杂质，纯度相对较高。并且由于BDH的活性受温度的影响很大，因而当温度达到高于50°C时，抗原抗体之间的作用力几乎消失，样品的回收率也是有保证的。由于BDH与anti-BDH存在一对一的关系，而一个线粒体也对应些许BDH。因此通过检测分离BDH所得到的纯度可以间接反映获得线粒体的纯度。PurificationstepsofBDHfromjerboaliverTotalprotein(mg)Specificactivity(nmol/min/mgofprotein)Totalactivity(pmol/min)Purificationfactor(fold)Yield(%)CrudeextractAmmonium5100100sulphate(30-50%)Phen560*82yl-Sepharose35065Sepharose-BlueImmu5017.60.8716.016noaffinitychromatography0.7541.30.03037.50.50Typicalexperimentswerereportedfromthreeindependenttrials.*Theammoniumsulphateprecipitationstepeliminates91%ofcontaminatingproteinsfromJerboacrudeextracts,respectively.ThesevalueswerecalculatedfromthetotalproteinamountdeducedfromtheamountofBDH(estimatedfromspecificactivitiesaftertheimmunoaffinitychromatographystep).chromatographystep).[5]根据上述表格中的数据简要的总结了BDH分离的结果。可以发现，比活在0.030U/mg蛋白质时最高，而此时分离得到的酶的产率最低为0.05%的总量和37的purificationfactor.从而由纯度较高的BDH获得线粒体的量相对较少。此外，与前一种方法相比，由于前者在分离洗涤过程中通过改变PH来进行anti-TOM22与TOM22分离，则必须加入酸性物质，从而必不可少的引入了杂质。虽然盐酸为挥发性酸，但其氯离子或多或少仍能够溶于水中，则线粒体的纯度收到了影响。在样品回收这方面，由于酸的介入，线粒体上一些蛋白的性质则会发生改变，因而样品的回收率也不如通过改变温度进行回收的地第二种方法来的高。三、苹果酸脱氢酶(MDH)及其同工酶：Holzer和他的合作者在一系列的论文中讲述了啤酒酵母菌中苹果酸脱氢酶的奇怪的行为。[9]~[15]Wittetal通过实验表明依赖葡萄糖生长的细胞中只含有线粒体酶的活性，而在没有葡萄糖的情况下，在细胞的线粒体和细胞质中发现苹果酸脱氢酶。根据相关研究发现，两种同工酶的抗体可以从兔子中获得，线粒体苹果酸脱氢酶的抗血清与这两种同工酶都可以发生反应。因此要想通过苹果酸脱氢酶与其抗体结合反应分离出线粒体，必须通过一定的方法将胞质中的苹果酸脱氢酶出去，进而在进行分离。胞质中的苹果酸脱氢酶大多分布于细胞膜上，因此破坏细胞膜成为我们分离线粒体的首要任务。I、细胞的培养：如上所说，细胞在不同的环境和中生长所得到的细胞是不一样的。按照EdgarHAGELE,JiirgenNEEFF,andDieterMECKE所提出的方法，我们可以得到符合条件的细胞材料。培养好的细胞存放-20°C环境中。[16]II苹果酸脱氢酶抗体的制备：除掉参比血清之后，如Williams和Chase所描述的那样用动物进行免疫。在该实验的最后将血从耳后静脉取出。在25C将制备好的纯净的苹果酸脱氢酶或者粗的浸膏剂加入到大量的抗血清中30分钟，使发生胶合。再通过离心机分离。III、细胞膜的破坏与分离：将培养好的细胞放在含有NaHCO、PH为7.5缓冲液的冰水混合溶液中，在Dounce离心机里面进行分离，从而将细胞膜分离出去。[17]W、线粒体的分离过程：应用抗原抗体反应，因排除了细胞膜上苹果酸脱氢酶的干扰，通过含有苹

果酸脱氢酶抗体的凝胶柱后，只有含有苹果酸脱氢酶的细胞器即线粒体能够吸附在凝胶柱上。取一等分的滤出液通过凝胶柱，重复几次。然后用equilibrationbuffer(20mMTris/HCl,1mMEDTA,1mMmercaptoethanolpH7.0彻夜洗涤，在0.5M的KCl和2MNaCl的作用下就可以将线粒体与抗苹果酸脱氢酶分离开来。[16]V、样品的回收以及试验方法的评价:rime(h)&LUJ5二苔XLMdc1、 苹果酸脱氢酶的活性大小影响着分离得到的线粒体的纯度。从葡萄糖这方面考虑：葡萄糖的多少与苹果酸脱氢酶活性的关系如下图所示：［16］从曲线的走向趋势可以看出葡萄糖对该酶的活性有着显著地影响。当加入葡萄糖5h的时候活性达到最大，此时分离线粒体最容易，也是产率最大的时候。但时间过短或者过长对改点分离得到的线粒体的纯度以及产率都有很大影响。由坡度可见。rime(h)&LUJ5二苔XLMdc2、 由于苹果酸脱氢酶既存在于细胞的线粒体中又存在于细胞膜中，而在实验过程中所需要的细胞是要通过培养所得，并不是说所有的细胞都可以。这方面存在一定的局限性，因此在实验过程中想要得到puremitochondria是一件比较困难的事情；3、 在分离线粒体之前，虽然将细胞膜出去，但也不能保证细胞质中就没有其他的含有游离的苹果酸脱氢酶的成分存在；4、 在抗原抗体分离的过程中也存在一定的不确定因素。抗原抗体分离过程中也可能会引入其他杂质。如改变PH，则必须引入酸性物质来调节溶液的酸碱度。且在收集的线粒体的纯度方面也是要大打折扣的。因此，这种方法相对于前三种方法相比其回收率是比较低的;总结(conclusion)：Antigen-antibody的结合是一种特异性的结合方式，具有很强的专一性。利用其进行分离一些目标物质其纯度是可以得到很好的保证的。由于线粒体是细胞的功能细胞器，是细胞的发电厂，在细胞的新陈代谢方面具有很重要的作用；又因其具有半自主复制的特性，因此对它的研究也就显得尤为重要。本文所提到的几种分离得到纯净线粒体的方法都是通过抗原抗体特异性的结合得到的，虽然在方法的大同小异，但不同抗原蛋白的选取对于实验的难易程度以及实验操作的便宜程度都具有重要的意义。尤其是最后我们选择苹果酸脱氢酶，可以说这份材料的选择就相当的不适合，虽然它有些许地方的可取之处。但就其纯度和线粒体的回收率方面都没有先前两种方法来的高。总的来说，线粒体的分离或许有好多方法可以实现，但抗原抗体反应这种专一性的分离方法是永远不会被最后考虑到的。参考文献：姜彬.蛋白质免疫印记分析法实验条件的研究 [J]实验技术与管理1002-4956(2008)05-0053-03Hue-TranHornig-Do,GrittGunther,MariaBust,etal.Isolationofmitochondriabysuperparamagneticmicrobeads[J]AnalyticalBiochemistry389(2009)1-5GBellot,P-FCartron,EEr,etal.Acorecomponentofthemitochondriaoutermembraneproteintranslocationpore,isamitochondrialreceptorfortheproapoptoticprotein[J]BaxCellDeathandDifferentiation(2007) 14, 785-794. doi:10.1038/sj.cdd.4402055;publishedonline10November2006TOM22,RussellGrimwade,Parkville,CrawleyTom22'.Tom22',an8-kDatrans-SiteReceptorinPlantsandProtozoans,IsaConservedFeDrissMountassif,PierreAndreoletti,ZakariaElKebbaj,etal.Immunoaffinitypurificationandcharacterizationofmitochondrialmembrane-boundD-3-hydroxybutyratedehydrogenasefromJaculusorientalis[J]BMCBiochemistry2008,9:26E.Fernandez-Vizarra,M.J.Lopez-Perez,J.A.Enriquez,Isolationofbiogeneticallycompetentmitochondriafrommammaliantissuesandculturedcells,Methods26(2002)292-297.N.K.Scheffler,S.W.Miller,A.K.Carroll,etal.Two-dimensionalelectrophoresisandmassspectrometricidentificationofmitochondrialproteinsfromanSH-SY5Yneuroblastomacellline,Mitochondrion1(2001)161-179.LatruffeN,GaudemerY:PropertiesandKineticmechanismofD-3-hydroxybutyratedehydrogenasefromratliversubmitochondrialparticles,Comparativeseffectsofdifferentthiolreagents.Biochimie1974,56:435-444.Witt,I.,Kronau,R.&Holzer,H.(1966)Biochim.Biophys.Ac~u118,,122-1