心血管基因治疗2014

心血管疾病的基因治疗心血管研究所

黄薇

副教授电话：82801589，email:huangwei@(508,18:40-20:30)第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义临床意义上的基因治疗，是指通过特定的载体，将外源性DNA编码的基因或者是对特定基因有修饰作用的DNA、RNA，可以直接导入特定的人体器官或特定部位（InVivo），也可以先导入到体外培养的细胞中，再将细胞导入人体(ExVivo)，从而起到治疗特定疾病的效应。第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症患者基因治疗成功。

10年后，

在法国9例ADA缺乏症患者接受治疗，3年后，3例患淋巴细胞白血病和恶性骨髓瘤。

迄今为止，1500多个临床方案被实施，累计几万人接受了治疗。在中国，人们以碳水化合物为主，高甘油三酯血症患者是高胆固醇血症患者的4倍。近来发现高甘油三酯血症可作为心血管疾病的独立发病因子，得到广泛重视和研究。图为脂蛋白脂酶基因缺陷导致的高甘油三酯小鼠，血浆呈牛奶状。小鼠极度高甘油三酯血症血浆中国山东病人极度高甘油三酯血症血浆脂蛋白脂酶LPL缺陷的基因治疗三、基因治疗的方法

（1）目的基因的制备

（2）靶细胞的选择和培养

（3）载体的选择

（4）导入方法第一节

基因治疗概论第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。目的基因的制备（基因治疗的策略）1.基因替代（genereplacement）

针对整个病变基因，不考虑基因上的致病性突变位点，将整个正常基因导入细

胞内，使外源正常基因在体内表达，达到治病的效果。2.基因修正（genecorrection）

针对致病基因的突变碱基序列，设计特殊的修正序列，导入细胞后，将致病基

因的突变位点置换下来，达到治病的效果。3.基因放大（geneaugmentation)基因放大通常选择和致病（缺陷）基因有互补或相近功能的基因，将此基因

导入后高表达，其发挥的功能可以纠正缺陷的病变基因。LDL-R-/-VLDL-R

第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。4.基因失活

（geneinactivation）

①反义技术（antisensetechnology）

反义核酸技术就是根据碱基互补原理，利用人工或生物合成特异互补的DNA或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术，包括反义寡核苷酸技术、反义RNA技术和核酶技术。（转录和翻译水平，特异阻断靶基因的表达）

②基因敲除技术（geneknock-out）或条件敲除（conditionalKO）

③RNA干扰（RNAinterference,geneknock-down）RNA(interference，RNAi）是由双链RNA（doublestrandedRNA,dsRNA）

分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。RNAi示意图四、基因治疗的方法

（1）目的基因的制备

（2）靶细胞的选择和培养（exvivo)

（3）载体的选择

（4）导入方法第一节

基因治疗概论第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。靶细胞的选择和培养

体细胞和生殖细胞1.体细胞：(1)成纤维细胞：

优点：①容易获取或体外培养，也容易植回体内；②易转染，并能稳定地表达外源目的基因，

合成和分泌的蛋白质可以通过血液供各种类型细胞使用；③回输的成纤维细胞很容易被取出。(2)造血干细胞：

优点：①取材比较容易，并易于输回体内；②造血干细胞具有不断分裂、分化成各种血细胞的潜能；③基因产物在骨髓细胞成熟后可以通过血液循环遍布全身。

缺点:①骨髓造血干细胞在骨髓细胞中所占比例极少(0.1%)，

提高基因转移效率，提高表达水平及延长表达时间.第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。(3)成肌细胞：

优点：①成肌细胞来源于骨骼肌，易获得；②成肌细胞易于体外培养；③成肌细胞具有增殖能力；④易于基因转移，并易与原位肌纤维融合，血管丰富。(4)血管内皮细胞：导管球囊携带DNA可成功地进行血管基因转移。

(5)淋巴细胞：

优点：①易提取，易体外培养并易于回输入体内；②基因转移效率较高。

缺点：回输体内后淋巴细胞的寿命短，需要经常输入.第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。2.生殖细胞（主要用在动物模型上）：

transgenicandknockoutanimalmodel四、基因治疗的方法

（1）目的基因的制备

（2）靶细胞的选择和培养

（3）载体的选择第一节

基因治疗概论第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。载体的选择病毒型载体和非病毒型载体

逆转录病毒（retrovirus，RV）载体

优点：

①

RNA反转录为DNA,

②感染效率高，并稳定持久地表达所带的外源基因

缺点：

①容量小，只能容纳8～10kb的外源基因片段；②血清补体能使之失活；③病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度；④病毒整合到DNA后，可能引起插入突变和激活癌基因的可能；⑤宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用上有一定局限性。理想载体:低毒，高效，大容量，可调控的基因转导。

第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。2.腺病毒（adenovirus，Ad）载体

线性双链DNA，36Kb

优点：①宿主领域广（感染分裂期，非分裂期细胞）②可获得高病毒效价，适用于临床③可直接体内注射④腺病毒颗粒比较稳定⑤插入外源基因容量大

缺点：①免疫原性强，只适用于短期感染（2-3周）②缺乏靶向性③可能有致病性

第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。3.腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）载体

单链线性DNA，缺陷病毒，动物病毒中最小的。

优点：①宿主范围广泛

②介导长期的基因表达，最有希望的病毒载体系统之一③插入突变的危险性低，生物安全性高

缺点：①载体容量有限（<5kb），不适于较大基因片段的插入②可用于癌基因治疗，但转染能力不如腺病毒

第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。4.慢病毒（lentivirus，LV）载体

反转录病毒的一种

优点：①既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞②转移基因片段容量较大③目的基因表达时间长④不易诱发免疫反应

缺点：①毒力恢复、垂直感染等安全问题

第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。非病毒载体原理：非病毒载体主要通过与DNA结合成颗粒复合物，然后将DNA导入细胞进而转移至细胞核。目前所应用的非病毒载体方法包括裸质粒直接应用、脂质体、阳离子多聚体(多聚赖氨酸PLL、聚乙烯亚胺PEI）、纳米颗粒载体等。优点：容量大、操作方便、安全和无免疫源性缺点：感染效率没有病毒高，高浓度是有细胞毒性，有的在体内不能降解。四、基因治疗的方法

（1）目的基因的制备

（2）靶细胞的选择和培养

（3）载体的选择

（4）导入方法第一节

基因治疗概论第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。ExVivo，细胞介导的基因治疗，首先将目的基因在体外导入到培养的细胞内，再将细胞移植到机体的特定器官或部位发挥作用（主要是以造血干细胞为主）。InVivo，组装了目的基因的载体将直接导入到所需部位，有直接注射，如在肌肉中表达的多点注射；缺血心肌直视下直接注射，静脉注射（肝脏为靶器官），肿瘤部位的注射。导入方法第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。基因治疗存在的问题及方向①目的基因在宿主体内表达不稳定，时间短，限制了基因治疗的疗效；②目的基因移植引起免疫系统对已识别过的外来物产生免疫增强，

使病人的治疗难以重复；③病毒载体对病人可能有各种潜在的危险；④许多疾病是由多基因紊乱引起，无法用单基因纠正解决问题。目标：高效性、靶向性、可调控性、安全性，尤其是在表达时间、部位、水平以及对各种信号反应的可调控性方面能够操控对单基因遗传病、恶性肿瘤的术后复发和转移、心血管病等，基因治疗提供了一个全新的治疗思路，为人类攻克这些不治之症带来了希望。第一节

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截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。第二节

基因治疗在心血管疾病中的应用研究动脉粥样硬化

（AS）第一节

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截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。HDLSMCECVEGFAS的基因治疗靶点FGFAPOA-ILCATABC-A1LDL第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。LDL-R1.LDL-R基因突变病人：血浆LDL增高,家族性高胆固醇血症（发病率1/500）。

它汀类药降低TC约30%左右。纯合子病人：对药物没有反应，迅速发生AS。

基因治疗在LDL-R-/-小鼠及兔，取得满意效果。3.临床试验：逆转录病毒介导的exvivoLDL受体基因治疗纯合子病人，

患者血浆LDL胆固醇只降低了将近30％。

由于基因治疗过程的复杂性，该研究没有继续扩大（肝脏组织

分离肝细胞

感染

回输）。APOB100：反义DNA技术，（II期临床，i.V.，降LDL40%），但GPT增高。RNAi

（III期临床）

AS的靶点LDL低密度脂蛋白第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。I期临床试验：主要进行两方面的试验，一方面药耐，另一方面是药代。

受试者是健康人（20例）。II期临床试验：安全性进行评价。患者参加（大于200例）。III期临床试验：治疗作用与安全性进行确认（大于400-500人）。IV期临床试验：国家规定一些新药在批准上市后，疗效，不良反应，药剂型观察等。临床药物试验分期第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。心力衰竭（heartfailure，HF）

已成为发病率和死亡率最高的疾病之一。

药物干预：β-肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张素II和醛固酮抑制剂

以及利尿剂等。

药物干预能够增加生存率，但是还远远不够理想，

因此很有必要发展一种新的治疗策略。第一节

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截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。心衰靶点第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。心衰靶点1

肌浆网Ca2+-ATPase

心衰时肌浆网SERCA2a活性的降低心衰大鼠，TAC（transaorticconstriction）的模型后，进行冠脉内Adv-SERCA2a转移，发现心肌的收缩和舒张功能改善，生存率提高。由二尖瓣损伤造成心衰的猪时发现，冠状动脉灌注介导的AAV1-SERCA2a两个月后，左室收缩性能和心肌重塑都有明显改善。临床研究方面，美国匹兹堡大学医学中心已经获准进行SERCA2a基因转移治疗晚期心力衰竭的I期临床试验，结果令人期待。SERCA2a第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。心衰靶点2

去磷酸化的PLN时能够与SERCA2a结合，从而抑制其活性；

反之，磷酸化的PLN对SERCA2a的抑制作用就会消失。

心衰时PLN活性增高，促进心衰。

腺相关病毒介导的突变的PLN-S16E（一种PLN抑制剂）。

能够防止罹患心肌病的仓鼠以及心梗后心衰大鼠的心肌病变。WatanabeA等人运用siRNA，导入新生大鼠心肌细胞，

使心肌细胞钙摄取功能得到恢复。运用反义核苷酸技术降低PLN水平，改善人类衰竭的心肌细胞的

收缩性和钙处理能力。

PLN第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。

微小RNAs（micro-RNAs，miRs)

miRs是体内存在的非编码的RNAs，约22个核苷酸序列。它们通过结合在靶基因的3’非编码区抑制蛋白的转录后翻译过程，或者诱导mRNA降解来达到抑制基因表达的作用。

通过抑制miR－195的表达，来达到减轻心肌肥大从而对抗心力衰竭的作用。

抑制miR-21能够抑制血管紧张素II和去氧肾上腺素诱导心肌肥大以及胚胎基因的表达，也具有抗心肌肥大和抗心衰的作用心衰靶点3第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。β-肾上腺素受体（β-adrenalinereceptor）系统心衰靶点41.β1-AR2.β2-ARβ-AR第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。缺血性心脏病的血管新生疗法1

Vale等对6例慢性心肌缺血患者心内膜下注射编码phVEGF-2的裸质粒，试验组心绞痛发作，硝酸甘油使用量明显减少，1年后平均缺血面积显著减少。Reilly等对30名加拿大心血管协会3～4级难治性心绞痛患者进行直接心肌内注射编码VEGF-2基因的裸质粒，1例术中死亡。一年内心绞痛得到明显改善。一年后有4例死亡、5例心梗、7例再手术，其他部位心肌缺血引起。

芬兰的一个研究组通过血管成形术和支架术导管灌注实施了Kuopio血管再生Ⅱ期临床试验，hVEGF-Ad或hVEGF-P/L。6个月后未见明显副作用，心肌灌注，有明显改善。VEGF第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。缺血性心血管病的血管新生疗法2FGFGrine在60例稳定型心绞痛患者中冠脉内注射Ad-FGF-4，FGF4可提高患者的运动耐力、减少心绞痛发作。

E2F：

细胞周期中主要转录因子，利用反义核苷酸技术，导入细胞后，

与转录因子E2F特异性结合，从而使转录因子丧失活化细胞周期的功能。

冠脉搭桥用的大隐静脉壁，增厚大大减轻(III期临床)E2F第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。高血压的治疗靶点①增强舒血管基因，即将正常舒血管基因DNA序列导入细胞，

使血管舒张基因过表达；②抑制缩血管基因，即将反义DNA序列或RNAi技术，

抑制血管收缩基因表达。第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。诱导基因表达：正义疗法（senseapproach）：

通过正义疗法在不同的高血压实验模型中过表达血管扩张剂,肾上腺髓质素，心房利钠肽，内皮型一氧化氮，血管紧张素II受体2型受体（AT2R）

第一节

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截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。降低基因表达：反义疗法（antisenseapproach）：

即根据靶基因的结构特点设计反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotide，ASODN）分子，通过静脉注射或靶组织局部注射，将能与靶基因结合的ASODN直接导入或以病毒为载体转染到体内，抑制收缩血管相关基因表达，减少缩血管物质的生成。AGT、ACE、AT1R，β1AR，C-fos，羧肽酶Y为靶基因RNAi：MR，TRPC3

（瞬时Ca通道）第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。心律失常靶点

目前，心律失常的分子遗传学研究主要集中于单基因遗传性疾病。至少明确8个基因的突变可引起心肌细胞离子通道的功能异常而导致心律失常，包括钾通道基因KCNQ1、KCNE1、HEGR、KCNE2和KCNJ2；钠通道基因SCN5A；钙释放通道基因RYR2，锚蛋白B基因（AnkyrinB）和起搏电流通道基因HCN4。第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。

心脏移植

基因治疗来解决器官移植排斥有着独特的优点：器官移植是把一个个体的组织或器官切取下来移植给另一个个体，这就为我们提供了一个在体外使用转基因载体改造供体器官或组织的时机。在局部表达免疫移植抑制分子，让受者免于全身使用免疫抑制剂，而且有望达到抗原特异性耐受的状态。第一节

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是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。基因治疗提高移植物存活的两条主要途径是：1.抑制抗移植物免疫反应2.促进移植物保护机制（一）同种异体移植第一节

基因治疗概论一、基因治疗（genetherapy）的定义

是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。二、基因治疗的历史回顾1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。

截止2000年，400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。

抑制排斥反应

T细胞反应体系

主要组织相容性复合物（MHC）

细胞因子：白细胞介素，γ-干扰素

趋化因子:vMIP-II和MC148Fas/Fas-L系统CD4+T细胞

次级淋巴组织受体第一节

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截止2000年，400多个临床方案被实施，累计35