山西农业大学科技创新项目管理合同书

山西农业大学大学生科技创新项目管理合同书（项目编号：9-031）项目名称 欧李PSY基因克隆、表达和功能研究项目负责人 承担单位 园艺学院 起止时间 2011.5—2012・4 填报日期2011年05月30日一、 项目研究内容：1欧李PSY基因全长分离根据GeneBank中已登录的PSY基因序列，设计简并引物，利用同源序列法分离欧李果实PSY基因片段，再通过3’-RACE和5’RACE技术克隆欧李PSY基因3’-末端序列和5’-末端序列，最后进行相关序列的拼接、组装和分析，获取欧李果实PSYcDNA全长序列；2欧李PSY基因生物信息分析利用生物信息工具和软件对分离的PSY基因进行生物信息学研究与分析，包括开放读码框分析、序列同源性比较、氨基酸疏水性分析、蛋白质跨膜预测、信号肽序列分析、分子进化树构建等；3欧李?，丫基因表达特性分析根据获得的PSYcDNA全长序列，设计特异引物，利用实时荧光定量RT-PCR分析PSY在欧李果实不同发育时期的表达特性，建立欧李果实发育过程中PSY基因的表达谱，探索欧李PSY基因在欧李果实类胡萝卜素合成和积累过程的转录调控规律；4欧李PSY基因在大肠杆菌中的功能表达根据获得的欧李PSYcDNA序列设计特异引物扩增欧李PSY开放读码框序列，将其克隆全原核表达载体pET-28a(+)，构建原核表达质粒pET-PSY；进一步将pET-PSY转入可合成和积累GGPP的工程大肠杆菌中诱导表达，利用高效液相色谱(HPLC)分析工程大肠杆菌中类胡萝卜素的合成和积累，从而对欧李PSY的功能特性进行分析和鉴定。二、 总体方案及拟采用的研究方法和技术路线：1总体方案项目拟以我国特有果树欧李为研究对象，利用RACE技术分离欧李果实类胡萝卜素合成关键酶基因psy，进一步通过现代生物信息学分析、实时定量RT-PCR技术及工程大肠杆菌异源表达体系等，对欧李psy基因的转录特性及功能特征进行研究，以期为欧李果实类胡萝卜素合成和积累的机制提供依据，也为今后改良欧李果实色泽和提高欧李果实营养品质奠定基础。2研究方法2.1试验材料收集试材选用山西农业大学园艺研究所选育的欧李(Cerasushumilis(Bge)Sok)优良品种‘农大4号’，从果实未成熟至完全成熟共分5个发育时期采集。样品采集后迅速将果肉分离，液氮冷冻后置于-80°C保存备用；2.2总RNA提取和cDNA合成采用TRIzol法提取果实总RNA，经DNaseI37C处理1h以去除DNA污染。利用RevertAidTM-MuLV试剂盒(MBILithuania)将处理后的RNA反转录合成第一链cDNA，具体参照试剂盒的操作说明书进行；2.3PSY基因全长cDNA序列分离技术根据GeneBank已登录的PSY基因保守序列区设计简并引物，以上述欧李果实cDNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得欧李PSY基因cDNA片段；通过RACE技术（RapidamplificationcDNAends）技术获得欧李PSY基因cDNA5’和3’末端序列，拼接欧李PSY基因的全长cDNA序列，具体操作参照FirstChoiceTMRLM-RACEkits（Ambion,USA）说明进行；2.4实时荧光定量RT-PCR分析基因表达根据上述获得的欧李PSY基因cDNA序列，设计特异引物，利用7500实时荧光定量PCR仪（ABI，USA）分析欧李PSY基因在果实不同发育时期的表达特性；具体的操作参照Liu等（2007）的方法进行；2.5欧李PSY基因在工程大肠杆菌体系中功能表达根据已获得欧李PSY基因cDNA全长序列，设计特异引物扩增其开放读码框序列，克隆到大肠杆菌原核表达载体pET-28a（+），获得原核表达重组质粒pET-PSY。将重组质粒pET-PSY转入可合成和积累GGPP的大肠杆菌工程菌株中诱导表达，根据大肠杆菌工程菌株颜色的变化或HPLC测定类胡萝卜素含量和组分的变化来鉴定欧李PSY蛋白的功能特性，具体的操作参照Cunningham等（1996）和Jayarai等（2007）的方法进行。3技术路线项目拟采取的技术路线如图所示。

姓名性别出生年月班级电话承担任务男1991.03对整个项目的实施男1992.01欧李PSY基因全长分离女1989.06欧李PSY生物信息学分析男1989.06欧李PSY基因表达特性分析男1992.081欧李PSY基因在大肠杆菌中功能表达五、指导教师基本情况：项目负责人姓名性别男出生年月1974.04学位研究生学历博士从事专业职称副教授住址山西农业大学家属院毕业时间2009.12毕业学校华中农业大学主要学术成就六、预期成果（论文、制作成品、实物等）及应用情况：1预期成果1.1获得欧李类胡萝卜素合成关键酶基因psy全长序列；1.2建立工程大肠杆菌颜色互补和番茄遗传转化技术平台；1.3在核心期刊上发表论文1-2篇。2应用情况2.1本项目通过对参与类胡萝卜素合成途径中的重要酶基因psy的研究，对于从分子水平上认识欧李类胡萝卜素生物合成途径、相关基因的表达调控以及相关酶的功能特性等问题具有重要的理论意义，同时本研究也为下步有目地的展开欧李果实“色泽育种”和品质改良奠定基础，也可为其它园艺作物品种改良提供新的思路和途径，具有一定的应有前景。2.2本项目研究获得的欧李的psy类胡萝卜素合成酶基因资源，可通过遗传转化的手段用于其它作物品质改良，获得富含胡萝卜素的新品种；也可通过微生物发酵技术大规模生产类胡萝卜素，以满足食品、化妆品及制药等不同行业的需要，具有潜在的应有价值。

七、资助经费用途（包括原材料、仪器设备、试验费等、并列出明细）:经费预算（元）科目总预算经费拟申请学校资助计算依据与说明测试/计算/分析费1000色谱测试、测试、弓1合物文献费1010资料印刷费材料/试剂/药品购置费400400定量RT-PCR试剂、分子生物学试剂（盒）、载体、色谱级色素标准品等旅差费500其它10090枪头、离心管、采样用品核准资助经费额：500元八、签约各方共同遵守的条款：1、 对合同执行情况实行中期检查，项目承担方必须于通知时间内提交中期进展报告，并提出后续计划。2、 合同完成后，项目承担方必须按合同规定的内容向甲方提交结题报告，并提供研究成果（论文、发表刊物原件、发明创造的样品或成品、制作实物、图片资料、参加课外科技竞赛活动的获奖证书复印件及其电子版资料）及完整的技术资料，甲方对乙方的技术诀窍、核心内容有保守秘密的义务。本项目成果属于学校。3、 乙方因故撤销合同，或并非因不可抗拒的客观原因致无法执行合同时，应视不同情况部分或全部退还所拨经费及物资、设备等。4、 合同所拨经费，应按科研经费开支范围的有关规定掌握使用，实行专款专用。5、 在合同执行过程中，如需修改某