基因工程载体

第四章基因工程载体

VesctorsforGeneticEngineering作为一个理想的载体，应具备以下条件：

载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体（vector）。

（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中；（3）具有容易检测的筛选标记；（4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。

第一节微生物基因工程载体

克隆载体（cloningvector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；表达载体（expressionvector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；穿梭载体（shuttlevector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。一、质粒载体

细菌质粒(plasmid)载体是基因工程中最常用的载体,它必须包括三种组成部分：复制必须区，选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点，MCS).

质粒DNA分子具有三种构型：

ClosedcircleDNA,ccDNA;supercoil;SC构型

OpencircleDNA,OC构型;LinerDNA,IDNA;L构型.1.严紧型和松驰型质粒严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有1～3个松驰型质粒：其拷贝数较多，一般20～60个，多的可达200～300个

2、转移型和非转移型质粒3.质粒的不相容性和不亲和群

转移型，结合型（conjugativeplasmid）是指一些质粒在不同的菌株中可以相互转移。

非转移型质粒(non-conjugativeplasmid)则只能在一种寄主中生存

质粒的不相容性：一般地，不同质粒不能共处在一个细胞中，这种特性称质粒的不相容性，当它们处在一起时，便有生存竞争，结果一种质粒繁殖，另一种逐渐被排斥，数目变少。不亲和群：彼此不相容的质粒组成一个不亲合群。

（二）、质粒的命名1、人工组建的质粒人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。例：pXYp109；pSC101等天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号括起来。如（C01E1）。农杆菌质粒用p加Ti（Tumerinducing）或At（Agrobacterium

tumefacions）表示，如pTiC58。2、天然载体质粒（三）、常用质粒载体

1.pSC101

图2.pBR322

（1）组成它由三部分组成：来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。

（2）特点（3）重组克隆的

“插入失活”筛选方法

具有多个单一的限制性内切酶位点。Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点（G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。

利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增。pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets

、Ampr——→在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在在含有四环素培养基上不生长；pBR322—→插入在Ampr中，基因型为Tetr

、Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可不生长；而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。

AmprTet

rTet

rAmpsPstI....

....涂布有Tet的培养基涂布有Amp的培养基......重组体的筛选外源基因的插入：.3、pUC系列质粒载体

（1）特点具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷贝数。具有多克隆位点可用组化方法鉴别：可通过插入失活法进行筛选含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因（LacZ′），它编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸，可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，即α—互补，恢复分解乳糖的能力。X-gal也是β-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β-半乳糖苷酶时，X-gal不被分解，菌落呈白色。当外源基因插入到pUC质粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。lacZ’lacZ’N端C端缺陷型大肠杆菌完整的β-半乳糖苷酶（四）大肠杆菌中的表达载体表达载体应含有：（1）强启动子（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。二、噬菌体载体

（一）、λ噬菌体载体

1、λ噬菌体载体的特征

λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp，两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称为cos位点。λ噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ噬菌体可作为基因载体的依据。

GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG环化作用2、λ噬菌体的缺陷与改造

λ噬菌体的改造⑴基因组太大（49kb）；⑵酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。⑶

野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA。

⑴切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；⑵去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；⑶

增加标记基因（remarkegene）。(4)

引入无义突变．λ噬菌体的缺陷：3.λ噬菌体的主要类型

（1）插入型载体

只有1～2种限制性核酸内切酶的单一切割位点

免疫功能失活大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活

（2）替换型载体

在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆载体

。这是由于构建此载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此，当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源DNA片段的能力。

（二）M13噬菌体载体

M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都编码蛋白质，有10个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。

M13噬菌体产生单双链DNA的机制。1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA。4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。

++-+-+-+-+-+-单链结合蛋白RF型DNA复制约200copy+++++以-链DNA为模板合成+链DNA三、噬菌粒载体（科斯质粒cosmid

）1、构建由质粒和λ噬菌体的粘性末端构建而成的。借用cos-（粘性尾巴）作字头，质粒的-mid作字尾，故称Cosmid，也叫粘粒载体。

2、特点（1）有λ噬菌体的高效感染能力。⑵

有质粒的高效复制特性。⑶有更广泛寄主。⑷有较大的容量。３．主要用途：用于DNA序列分析四、酵母菌载体

①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。②含有酵母的筛选标记，这样当重组质粒转入相应的酵母细胞后，可用来筛选重组体。③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。共同的特点：多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为2μ质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（ARS片段）。

根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、附加型和稳定型等类型。

整合型：含有酵母的筛选标记ura3，但不具有酵母的复制起始点该质粒DNA以单拷贝形式稳定遗传，缺点是转化率较低（1～10转化子/μgDNA）

复制型：是酵母DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的，插入片段含有酵母的筛选标记ura3和2uDNA片段，一般以低拷贝数维持在酵母染色体之外。复制型载体对酶母的转化率极高（102～103转化子/μgDNA），但是转化子不稳定，容易丢失。

附加型：是在pBR322中插入酵母筛选标记和2uDNA的ARS序列构建成的。这种质粒以附加体的形式存在于真核细胞中。附加型型载体对酵母具有很高的转化活性（102～103转化子/μgDNA），且与复制型相比，稳定性高，拷贝数也较高（25～100分子/细胞）。

稳定型：在附加型载体中再插入酵母着丝粒的一个DNA片段（CEN）。

第二节

植物基因工程载体

一、根癌农杆菌及Ti质粒

（一）、根癌农杆菌与冠瘿瘤

根癌农杆菌属根瘤菌科农杆菌属，通过伤口可感染双子叶植物，并在创伤部位使组织恶性增生而形成植物肿瘤，叫冠瘿瘤（crowngalltumor）。冠瘿碱类植物激素章鱼碱胭脂碱农杆碱（二）、Ti质粒及T-DNA的结构与功能

1、T-DNA区Ti质粒是农杆菌非染色体的环状双链DNA分子，分子量为90×106～150×106道尔顿，有16~240kb。致病菌株37℃培养治愈菌株（Ti质粒被消除）治愈菌株

与致病菌株接合致病菌株（重新获得Ti质粒）胭脂碱型质粒T区大小约23kb，单一序列插入植物核DNA。章鱼碱型左区(TL-DNA)：长约13kb，通常为单拷贝，有诱发和维持肿瘤的作用。右区(TR-DNA)：长约7kb，多拷贝的含有参与冠瘿碱生物合成的蛋白酶的编码基因。图章鱼碱pTiAch5和胭脂碱pTiC58质粒的遗传图共同区：T区有控制肿瘤形态和编码冠瘿碱合成酶基因，实际上shi基因与生长素合成有关。roi基因与细胞分裂素合成有关，Ocs是章鱼碱合成酶基因，Agr是编码农杆碱合成酶基因，章鱼碱型与胭脂碱型的T区中上述基因分布不完全一致，但90％是相同的称共同区。3个同源区段，含有6个基因位点，是冠瘿瘤形成所必需的，统称“致癌基因”(oncogene，onc)。

非同源序列则编码冠瘿碱合成酶，在胭脂碱型中叫Nos，章鱼碱型酶叫Ocs。

共同区已知T-DNA的两侧是被一对保守的25bp的重复序列包围着，而且在一系列不同的植物肿瘤DNA中发现，T-DNA的两边端点是位于这种同向重复序列的当中或附近，这种同向重复序列实际上就是T-DNA的边缘区。右侧边缘区又叫RB序列，左侧边缘区又叫LB序列。2、毒性Vir

区，VirA、B、D和G为致瘤性，它们的突变型为非致病性。VirA、C、D编码专一核酸内切酶蛋白，与VirB共同作用，与T-DNA迁移直接有关。VirC部分决定寄主范围VirE与菌体感染过程有关Vir区大约35kb，包含6个互补群，A、B、C、D、E、G。

3、代谢区Tra，T-DNA转移功能；Agr，农杆碱代谢；Inc，不同类型质粒代谢相容性；Occ和Noc，章鱼碱和胭脂碱分解代谢。（三）农杆菌对寄主的侵染和T-DNA的转移

1、侵染过程2、T-DNA的转移（1）创伤植物细胞释放出可激活Ti质粒Vir基因进行转录的蛋白因子；（2）VirA和VirD蛋白因子进一步激活其它的Vir基因进行表达；（3）先在Ti质粒右侧边缘区产生出头一个单链缺口；（4）接着在Ti质粒左侧边缘区产生出另一个单链缺口，结果释放出的单链T-DNA分子便定向地转移到植物细胞，并随机整合到寄主染色体基因组上；（5）Ti质粒中移走的单链T-DNA区，通过DNA复制得到修复。（四）Ti质粒作为植物基因工程的载体

1、可行性2、存在缺陷（1）转化植物细胞很难形成完整植株。（2）质粒上分布着多个酶切位点，而不是单一切点，酶切后不易成环，给插入目的基因带来困难。（3）Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，可农杆菌对Ti的转化率太低，只有10—9～10—7左右。（1）将细菌转座子Tn7插入胭脂碱合成酶基因（Nos）位置上，该Ti质粒仍能实现T-DNA转移。

（2）用Cat与Nos和Ocs基因启动子拼接后，重组进入Ti质粒，Ti质粒感染植物，植物细胞中检测到了Cat基因的酶的存在。

（五）Ti质粒的改造

1、去除致瘤基因Onc

由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，记为Onc—，这个过程叫“卸甲”、

“缴械”或“解除武装”，构建的Onc—载体叫“卸甲载体”。例：pGV38502、共整合质粒

（1）首先构建中间载体，如将大肠杆菌pBR322质粒带上一段与Ti质粒T区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；（2）然后将目的基因插入该片段的适当位置，这样使目的基因两端带上了与Ti质粒T-DNA同源的DNA序列；（3）然后再将该质粒通过转化或接合引入含有Ti质粒的农杆菌中。（4）引入的衍生质粒和原细胞中Ti质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到Ti质粒上，使之产生真正的具有外源基因的Ti质粒，称共整合质粒。

3、双元载体

“双元载体”，也称反式载体，是指由两个分别含T-DNA和Vir相容性Ti质粒构成的双质粒系统。

含有为T-DNA转移所必须的Vir区的质粒，另一个则是含有T-DNA区段的寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。4、载体盒

所谓“载体盒”(Vectorcassette)是将植物的标志基因、多插入位点、细菌标志基因和质粒的复制启动子位点等集于一身的质粒系统，象一个集装箱似的集合在一起。

二、Ri质粒载体

三、CaMV(花椰菜花叶病毒)载体系统

Ri质粒其结构和功能与Ti十分相似。与Ti质粒相比的优点：可以构建完整的Onc+载体。花椰菜花叶病毒(caulimovirus，简称CaMV)实际上是一个病毒群，已知有12个种，每个种的寄主范围都很窄，不感染豆类和单子叶植株，它的主要寄主是芸苔属。

CaMVDNA有两个特别之点，一是在专一位点有不连续性，DNA链上有一处到三处不连续；另一点是在电镜下观察到DNA大部分有盘绕结构，看上去似超螺旋。1、互补载体系统

2、混合载体系统

缺陷性CaMV+辅助病毒分子

将CaMVDNA克隆到了Ti质粒上，通过农杆菌导入植物细胞，可产生典型的病毒感染症状。

3、CaMV35S启动子融合基因载体系统

SalI

Kmr

SalISalITi质粒T-DNA区SalI

Kmr

SalI混合载体构建过程SalISalISalI四、脂质体(1iposomes)载体

（一）、脂质体结构与性质

脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂双分子层围成的囊状结构，这种结构是一种分子排列有序的近晶型液晶。脂质体的主要成分是磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺等。

图（二）脂质体与细胞的相互作用

制备方法：有超声波法、机械振荡法、透析法、融合法以及逆向蒸发法等。

脂质体作为载体的机理与细菌球质体的作用是相似的，它能将DNA包埋在里边，在PEG诱导下，通过细胞的吞噬或融合作用将内含物转入受体细胞，最终与受体核DNA结合。脂质体与细胞的相互作用主要有以下几种形式：

1.内吞作用2.融合作用3.交换作用

优点：使包装在里边的物质（质粒或DNA）能避开核酸酶的降解，对受体无毒性，易被吸收，运送率高，转化率高。更重要的是脂质体制备比常用的质粒