基因组与比较基因组学

第九章基因组与比较基因组学

9.1人工染色体构建

9.2新的测序策略--全基因组鸟枪法测序

9.3全基因组序列分析--基因组学的新内容

9.4

比较基因组学(Comparativegenomics)

9.1人工染色体构建

1983年，美国的Dana-Farber癌症研究所和哈佛大学医学院的教授首次在Nature上发表文章，报道了构建YAC（YeastArtificialChromosome）库的过程。1987年，Burke等人发现，仅仅带有ARS序列(autonomousreplicatingsequence)的载体虽然能够被复制，但极易在有丝分裂时丢失。即使在选择培养基上，也只有5%-20%的子代细胞带有ARS载体。加入Centromeres（CEN）能显著提高ARS质粒在有丝分裂时的稳定性，90%以上子代细胞带有该载体。CEN还能显著降低拷贝数，从20-50/细胞降为1-2/细胞。（Science,236:806-812）。

人工染色体含有三种必需成分：着丝粒、端粒和复制起点。

着丝粒(CEN)位于染色体中央，呈纽扣状结构，在有丝分裂时结合微管并调控染色体的运动，也是姐妹染色单体配对时的最后位点，接收细胞信号而使姐妹染色体分开。

端粒（TEL）：主要功能是防止染色体融合、降解、确保其完整复制。端粒酶以其自身RNA为模板，在染色体端部添加上端粒重复序列，并参与端粒长度和细胞增殖的调控。

复制起点：DNA复制通常由起始蛋白与特定的DNA序列相互作用开始。DNA合成的起始位点和DNA复制起点(遗传位点)所需的Cis靶区常位于同一段长约100bp的DNA上。

YAC的主要缺点

1．存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；

2．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；

3．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构。

4．操作时容易发生染色体机械切割。

以细菌寄主系统为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低，转化效率高，又易于分离。科学家用"染色体建造"法用F质粒及其调控基因构建细菌载体，克隆大片段DNA。该质粒主要包括oriS，repE（控制F质粒复制）和parA、parB（控制拷贝数）等成分。

BAC的优点

1．易于用电击法转化E.coli（转化效率比转化酵母高10-100倍）；2．超螺旋环状载体，易于操作；3．F‘质粒本身所带的基因控制了质粒的复制；4．很少发生体内重排。有人把人类染色体端粒DNA上单个α-卫星DNA单元多聚化形成1Mb左右的大片段并与人类基因组DNA混合，产生了能被复制、能正常分裂并得到长期稳定保存的人工合成的染色体，长度约为6-10Mb，称为MAC或HAC。

9.2新的测序策略--全基因组鸟枪法测序

对某基因组文库全部克隆片段进行末端序列测定中未测到的碱基数，即缺口(gap)，与已测定的总碱基数相关。随着已测定碱基数的增加，缺口的总碱基数目会按照泊松公式的一个推论（P=e-m）迅速减小。其中P为基因组中某个碱基未被测定的概率，m为所测定的碱基数与基因组大小相比的倍数。m越大P值越小。当m值达到5（即随机测定的碱基数达到基因组5倍时），基因组中未测定的碱基数为基因组总碱基数的0.67%(e-5=0.0067)。对流感嗜血杆菌这样大的基因组(1.83Mb)，可能留有128个平均长度为100bp的缺口。全基因组鸟枪法测序的主要步骤

第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。第二，高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序，TIGR在完成流感嗜血杆菌的基因组时，使用了14台测序仪，用三个月时间完成了必需的28,463个测序反应，测序总长度达6倍基因组。第三，序列集合。TIGR发展了新的软件，修改了序列集合规则以最大限度地排除错误的连锁匹配。第四，填补缺口。有两种待填补的缺口，一是没有相应模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未测序的序列缺口。他们建立了插入片段为15-20kb的λ文库以备缺口填补。

鸟枪法测序的缺点

对鸟枪法的改进

(1)Clonecontig法。首先用稀有内切酶把待测基因组降解为数百kb以上的片段，再分别测序。(2)靶标鸟枪法(diretedshotgun)。首先根据染色体上已知基因和标记的位置来确定部分DNA片段的相对位置，再逐步缩小各片段之间的缺口。一些常见的缩写

SSLPs,simplesequencelengthpolymorphisms;

STRs,simpletandemrepeats;

SNPs,singlenucleotidepolymorphisms.

LINEs,longinterspersednuclearelements;

SINEs,shortinterspersednuclearelements;

LTR,longterminalrepeat.

FISH,FluorescentinsituHybridization;

STS,SequenceTaggedSite

EST,EndSequenceTag.9.3全基因组序列分析--基因组学的新内容

1．数据存放。

2．碱基百分含量分析。无论是GC富含区还是AT富含区，都可能是一些特殊功能的区域。

肺炎支原体GC百分含量高和GC百分含量低的区域对应于重组值较低的区域，包括着丝粒和端粒，而尿殖道支原体GC百分含量最低的区域对应于rRNA和tRNA。流感嗜血杆菌GC百分含量高的区域也对应于6个rRNA基因。

3.ORF分析。首先要用多个不同的软件来要找到并估测基因组中的每一个ORF。

(1)通过流感嗜血杆菌能量代谢类群的ORF分析，了解到在这种生物中缺乏三羧酸循环(TCA)中必需的三个酶，即柠檬酸合成酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因和顺乌头酸酶基因。由此推断流感嗜血杆菌TCA缺失，不能合成谷氨酸，因为谷氨酸的供体是TCA的中间产生物α-酮戊二酸。

(2)在尿殖道支原体基因组中有一个称为MgPa的ORF。考察全基因组，共发现有9个与MgPa同源