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文档简介

碱性磷酸酶

的动力学分析酶促反应动力学：研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。影响因素包括：酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。碱性磷酸酶

米氏常数的测定原理米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出Km的方法。在酶促反应中，当反应体系的温度、pH及酶浓度恒定时，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。米氏方程式：反应速率与底物浓度关系的数学方程式

。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速率Vmax：最大反应速率(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]

Km+[S]＝──VmaxV[S]KmVmax/2Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。酶底物复合物E+SE+PES(过渡态)

Vmax[S]Km+[S]V=（林－贝氏方程）+1/V=KmVmax

1/Vmax1/[S]两边同取倒数双倒数作图法-1/Km

1/Vmax1/[S]1/V本实验以碱性磷酸酶（AKP）为材料，用磷酸苯二钠为其底物。AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物。根据红色的深浅可测出酚的含量，进而算出相应的酶活性(V)。再根据Lineweaver—Burk法作图，计算其Km值。操作

底物浓度对酶促反应速度的影响

1)取试管8支，按下表操作(应特别注意准确吸取底物溶液及酶液)：加入酶液立即计时，混匀后置37℃水浴准确保温15min。2)保温结束，各管立即加入碱性溶液1ml以终止反应。3)各管中分别加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5％铁氰化钾2ml，混匀，放置l0min，以第8管调零点，于510nm波长处比色，测定各管吸光度。酶促反应速度计算酶促反应速度以每15分钟所产生酚的微克数(μg

／15min)来表示。根据酚标准曲线查出各管的酚含量，即各管在不同底物浓度下的反应速度。本实验不制作酚标准曲线，而以1／[S]对1／A作图，因各管吸光度与其酚含量成正比，故可用吸光度代表酶促反应速度。注意事项(1)底物浓度和酶浓度都对酶促反应速度产生巨大影响，故该实验的成功与否，在很大程度上取决于各种试剂(特别是底物溶液和酶液)吸液量的准确性。(2)

加入酶液立即计时，混匀后置37℃水浴准确保温15min。

实验记录碱性磷酸酶米氏常数的测定日期、室温A

12345678

0.000实验报告

碱性磷酸酶米氏常数的测定日期室温一、实验目的二、实验原理三、数据处理（一）绘制米氏方程式曲线（二）绘制双倒数曲线四、实验结果：AKP的Km=五、实验讨论（一）绘制米氏方程式曲线A

123456780.000Smmol/L234568160ＶVmax[S]

Km+[S]＝──AKP米氏方程式曲线图A[S]（二）绘制双倒数曲线1/A

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