酶工程第10章固定化酶催化的动力学特征

第十章固定化酶催化的动力学特征一、酶的固定化对其动力学特性的影响二、影响固定化酶动力学的因素三、外扩散限制效应四、内扩散限制效应一、酶的固定化对其动力学特性的影响1．酶活性的变化酶在固定化时，总会有一部分未被固定而残留在溶液中，造成了酶的部分损失；同时由于各种原因也会造成已被固定的酶的活性有所下降。这是大多数固定化酶的情况，只有个别的酶在固定化后活性未变或反而升高。如果固定化酶的动力学仍服从米氏方程，则可通过米氏常数Km值的大小来反映酶在固定化前后活性的变化。一些酶在溶液中和固定化后的米氏常数值

酶底物固定化试剂Km（mol/L）

肌酸激酶ATP无（溶液酶）对氨苯基纤维素6.5×10－48.0×10－4

乳酸脱氢酶NADH无（溶液酶）丙酰玻璃7.8×10－65.5×10－5

α－糜蛋白酶N-乙酰酪氨酸乙酯无（溶液酶）可溶性醛葡聚糖

1.0×10－31.3×10－3

无花果蛋白酶N-苯酰精氨酸乙酯无（溶液酶）CM-纤维-702×10－22×10－2

胰蛋白酶苯酰精氨酰胺无（溶液酶）马来酸/1,2-亚乙基

6.8×10－32.0×10－4

酶活性变化的评价指标酶活性表现率：

指实际测定的固定化酶的总活性与被固定化了的酶在溶液状态时的总活性之比。酶活性收率：指实际测定的固定化酶的总活性与固定化时所用的全部游离酶的活性之比。

上述两种评价指标的差别在于是否考虑了剩余的未被固定化的酶。2．酶稳定性的变化一般来说，酶被固定化后，无论是保存时的稳定性，还是使用时的稳定性均有提高。据理论推测，酶固定化后其半寿期将增加1倍。同时，固定化酶的热稳定性也有所提高，要比溶液酶提高10多倍。这是因为固定化后，酶的空间结构变得更为坚固，加热时不易变性，增加了酶的热稳定性。

二、影响固定化酶动力学的因素1．空间效应：（1）构象效应

酶的活性部位和变构部位的性质取决于酶分子的三维空间结构。酶在固定化过程中，由于存在着酶和载体的相互作用，从而引起了酶的活性部位发生某种扭曲变形，改变了酶活性部位的三维结构，减弱了酶与底物的结合能力，此种现象称为构象效应。影响固定化酶动力学的因素1．空间效应：（2）屏蔽效应载体的存在又可产生屏蔽效应，或称为位阻效应。因为载体的存在使酶分子的活性基团不易与底物接触，从而对酶的活性部位造成了空间障碍，使酶活性下降。影响固定化酶动力学的因素2．分配效应当固定化酶处在反应体系的主体溶液中时，反应体系成为固液非均相体系。人们常把固定化酶颗粒附近的环境称为微环境，而把主体溶液体系称为宏观环境。由于固定化酶的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定化酶载体内部底物或产物浓度与溶液主体中浓度不同的现象称为分配效应。分配效应中的分配系数

这种分配效应一般采用液固界面内外侧的底物浓度之比，即分配系数来定量表示。设界面内侧的底物浓度为[S]i，界面外侧的底物浓度为[S]o，则分配系数K可表示为：静电作用造成的分配效应

通常酶可能被固定在带电荷的酶膜上或载体上。底物在溶液中也会离子化，这样在固定的电荷和移动的离子之间，常会发生静电相互作用，产生分配效应。根据Boltzman分配定律，分配系数K可以表示为式中

Z—底物分子所带的电荷；F—法拉第常数；U—载体的静电电势；R—气体常数；T—绝对温度。

当载体与底物所带的电荷相反时，K大于1；当两者带有相同电荷时，K小于1。

考虑静电作用的反应速度方程对于固定化酶催化的反应，其底物浓度应取在固定化酶内外表面附近的微环境的数值。因为，当Z和U异号时，K>1，，反应速度增高；反之，，反应速度降低；当任何一方电荷为零时，不变。影响固定化酶动力学的因素3．扩散效应固定化酶催化反应时，底物必须从主体溶液进入到固定化酶内部的活性中心处，反应的产物又必须从固定化酶的活性中心传出到主体溶液中。这种物质的传递过程主要是扩散过程，扩散的速率在某些情况下会对酶反应速度产生限制作用，特别是当扩散速率缓慢而酶的催化活性又很高时，这种限制作用会相当明显。

外扩散和内扩散

外扩散是指底物从主体溶液向固定化酶的外表面的扩散，或产物从固定化酶的外表面向主体溶液中的扩散。外扩散发生在酶反应之前或之后。由于外扩散阻力的存在，使底物或产物在主体溶液和固定化酶外表面之间产生浓度梯度。

内扩散是对有微孔的载体而言。底物从固定化酶的外表面扩散到微孔内部的酶活性中心处，或是产物沿着相反途径的扩散。对底物而言，内扩散限制与酶催化反应同时进行。固定化酶底物和产物的分布状况酶的本征动力学空间效应难以定量描述，并且它与固定化方法、载体的结构及性质、底物分子的大小和形状等因素有关。空间效应的影响一般是通过校正动力学参数Vm和Km来体现的。在此基础上建立起来的动力学方程一般称之为本征动力学（intrinsicdynamics），所测得的反应速度称为本征反应速度。

本征动力学是指酶的真实动力学行为，包括溶液酶和固定化酶。对于后者，它仅将空间效应的影响考虑在内。从这个意义上讲，固定化酶的本征动力学与溶液酶的本征动力学是有差别的。固有动力学分配效应造成的结果是使微观环境与宏观环境的底物浓度出现差别，从而影响酶催化反应的速度。如果在上述本征动力学的基础上，加上这种分配效应造成的浓度差异对动力学产生的影响，所建立的动力学称为固有动力学（inherentdynamics）。对这种动力学比较简单的处理方法是：动力学方程仍然服从米氏方程的形式，仅对动力学参数予以修正。有效动力学不论分配效应是否存在，固定化酶受到扩散限制时所观察到的反应速度称为有效反应速度，此时的动力学称为有效动力学（effectivedynamics），或称宏观动力学。由于生化物质在溶液内和固定化酶微孔内的扩散速率是比较慢的，所以扩散阻力是影响固定化酶催化活性的主要因素，并且建立起来的有效动力学方程也不完全服从米氏方程。

几种动力学之间的关系固定化酶反应动力学的特征

对固定化酶反应动力学，不仅要考虑固定化酶本身的活性变化，还要考虑到底物等物质的传质速率的影响，而传质速率又与底物等物质的性质和载体的性质，以及操作条件等因素有关。因此对于这样一个为非均相体系建立起来的动力学方程，不仅包括酶的催化反应速度，而且还包括了传质速率。这是固定化酶催化反应过程动力学最主要的特征。三、外扩散限制效应为了集中研究外扩散限制效应，常选用液体不能渗透的无电活性的固定化酶膜或固定化酶颗粒作为研究的模型。在这种情况下，固定化酶催化反应的过程包括3步：①底物从主体溶液扩散到固定化酶的外表面；②底物在固定化酶的外表面上进行反应；③产物从固定化酶的外表面扩散进入主体溶液。其中，①和③为单纯的传质过程，②为催化反应过程。其中任一步速率发生变化，都会影响到整个酶反应速度。

外扩散限制效应假定一不带电荷的固定化酶，其外表面上的反应速度符合米氏方程形式，即

式中：Vi为底物在固定化酶外表面上的消耗速度，又称宏观反应速度，单位为mol/(L·s)；

[S]i为底物在固定化酶外表面上的浓度，单位为mol/L。外扩散限制效应

底物由主体溶液扩散到固定化酶外表面的速率应表示为

式中：Vd为底物由主体溶液扩散到固定化酶外表面的速率，单位为mol/(L·s)；

kL

为液膜的传质系数，“m/s”；

a

为单位体积所具有的传质表面积，“m-1”；

kLa为体积传质系数，“s-1”；[S]0为底物在主体溶液中的浓度，“mol/L”

外扩散限制效应在稳态条件下，应有

，即

该式表示在稳态条件下，外扩散传质速率等于在固定化酶外表面上底物的反应速度。

外扩散限制效应

当外扩散传质速率很快，而固定化酶外表面的反应速度相对较慢，成为该反应过程速度的限制步骤时，固定化酶外表面的底物浓度应为主体溶液中的底物浓度，即。这时的反应速度应为在这种情况下，酶反应速度不受传质速率的影响，为该酶的本征反应速度，或称在此条件下可能达到的最大反应速度，用表示。

外扩散限制效应

当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应速度很快，此时传质速率成为限制步骤。固定化酶外表面上的底物浓度趋于零，有

在这种情况下，酶反应速度与最大传质速率相等，用表示。

外扩散限制效应上述两种情况为两种极端的情况，一般的情况处于这两者之间，称为过渡区，如图所示。在过渡区的酶反应速度为宏观反应速度，它可由两种方法求得。（1）由[S]i值确定Vi值在过渡区，[S]i值应满足方程

外扩散限制效应由可得

两边同除以[S]0，并给方程左边的分子分母同除以[S]0得

外扩散限制效应引入，，并定义，

式中：为无因次底物浓度；为无因次米氏常数；为无因次准数，常称为Damköhler

（丹克莱尔）准数。

外扩散限制效应将上式整理成一元二次方程标准形式

令，代入上式得

解此方程可得

根据题意，只能为正值，故

外扩散限制效应解出后，根据求出，再将

代入即可求出

在上述方法中，是一个重要的无因次准数，其物理意义为

外扩散限制效应在上述方法中，是一个重要的无因次准数，其物理意义为

当<<1时，酶催化的最大反应速度要大大慢于底物的传质速率，此时该反应过程由反应动力学控制；当>>1时，底物的传质速率大大慢于酶催化的最大反应速度，此时该反应过程由传质扩散控制。

外扩散限制效应（2）作图法求[S]i值和Vi值根据，底物在固定化酶外表面的浓度应同时满足传质速率方程式和反应速度方程式，因此也可通过作图法求出值和相应的值。

外扩散限制效应四、内扩散限制效应

对于固定于多孔性载体中的固定化酶，其催化反应的主要部位是在颗粒内部。内扩散阻力主要来自于微孔内的阻力。这种内扩散阻力的大小与固定化酶颗粒内部的物理结构参数、反应物的性质等因素有关。在讨论内扩散对固定化酶催化反应动力学的影响时，常将均匀分布着酶的多孔球形颗粒作为研究的模型。因此要首先研究颗粒载体的结构参数和物质在微孔内的扩散。1．载体的结构参数a．比表面积Sg它指单位质量载体所具有的内表面积，以m2/g表示。通过实验测定，一般载体的比表面积可达200～300m2/g。b．微孔半径多孔载体的内表面积与微孔孔径的大小有关。孔径越小，比表面积越大。若单位质量载体所具有的孔体积以Vg表示，则平均微孔半径为

微孔半径的计算设微孔为圆柱状管道，长为l，半径为r

，则其内表面积（不算两端）孔体积

两式相除，

载体的结构参数c．孔隙率载体的孔隙率为载体颗粒内孔隙所占有的体积与该颗粒体积之比。因此值恒小于1，它在数值上与Vg的关系为

。式中为表观密度，它表示单位颗粒体积中所含有的固体的质量。

载体的结构参数d．颗粒当量直径为了表示不同形状固定化酶颗粒的大小，一般采用如下方法：①以与颗粒体积相等的球体直径dV表示，称为“体积相当直径”；②以与颗粒外表面积相等的球体直径dS

表示，称为“外表面积相当直径”；③以与颗粒的比表面积相等的球体直径dSV表示，称为“比表面积相当直径”。体积相当直径对于同一非球形颗粒，按上述不同定义表示的当量直径在数值上是不同的。假设某任一形状的固定化酶颗粒，其体积为VP，外表面积为AP，则根据上述定义的各当量直径分别为：体积相当直径dV外表面积相当直径外表面积相当直径dS

比表面积相当直径

比表面积相当直径dSV形状系数ψ描述颗粒形状可引入形状系数的概念，用ψ表示。其定义为与颗粒体积相同的球体的外表面积AS与颗粒的外表面积AP之比，即ψ＝。由于体积相同的几何体中球体的外表面积最小，所以一般是AS<AP，ψ<1。如果颗粒就是球体，则ψ＝1。ψ表示了任意颗粒的外形与球体相接近的程度，故又称为圆球度。正方体颗粒的圆球度为0.806。

载体的结构参数e．颗粒密度颗粒密度有3种定义方法：颗粒表观密度固体的质量/颗粒的体积颗粒真密度固体的质量/固体的体积颗粒堆密度固体的质量/床层的体积上述3种密度的差别在于体积计算的不同，显然存在。

2．物质在微孔内的扩散分子在微孔内的扩散分为两种机理：①一种称为分子扩散，此种扩散的阻力来自于分子之间的碰撞，扩散速率主要受分子之间相互碰撞的影响，而与微孔直径的大小无关。②另一种称为努森（Knudson）扩散，其扩散的阻力主要来自于分子与孔壁之间的碰撞，而分子之间的碰撞影响较小。它常发生在微孔直径较小的情况下。分子扩散与努森扩散

微孔内某一组分进行的扩散属于哪一种扩散机理，与分子运动的平均自由程及微孔直径的

d

相对大小有关。当≤0.01时（也就是平均自由程相对短且微孔直径相对大时），为分子扩散；当≥10时（也就是平均自由程相对长且微孔直径相对小时），为努森扩散。介于这两者之间则属于两种扩散机理并存。微孔内液体分子的扩散速率在液体中，由于液体中的分子的平均自由程很小，所以液体在微孔内的扩散机理一般视为分子扩散。其扩散速率由分子扩散系数决定，而液体的分子扩散系数比气体的分子扩散系数小得多。微孔内液体分子的扩散速率可用Fick定律来表达：式中：Ns为底物S的扩散通量；x为沿扩散方向的距离；De为底物S在微孔内的有效扩散系数。

分子扩散系数与有效扩散系数

有些固定化酶颗粒，其颗粒内部的微孔是弯弯曲曲的，而不是整齐的圆柱体，微孔的大小也不均匀，微孔之间可能封闭，也可能相通。因此与在主体溶液中进行的分子扩散相比，扩散阻力明显增大，其有效扩散系数要比分子扩散系数小。

曲节因子当固定化酶颗粒内部的微孔是任意取向，颗粒的孔隙率为时，对颗粒单位外表面积而言，微孔的开口面积所占的分数也为。各微孔可能相互交叉，各微孔的形状和同一微孔不同部位的截面积也存在差异，这使得分子在颗粒内的扩散与在一圆柱形的微孔内的扩散显然是不同的，常引入一个校正参数对此进行校正，称为曲节因子，或称为弯曲系数、沟路曲折系数等。位阻因子有时底物或产物可能是大分子，此时微孔壁会对这些大分子产生一定的阻碍作用，此作用常以位阻因子H表示。考虑到上述因素，有效扩散系数De与分子扩散系数D的关系为式中：为固定化酶颗粒的孔隙率，其值为0～1；为曲节因子，其值一般为1.4～7；H——位阻因子，其值为0～1。

大分子的受阻扩散

当微孔直径比扩散分子直径大得多时，位阻因子H近似为1。但在某些情况下，例如蛋白质分子的扩散，其直径与微孔直径几乎为同一数量级，此时，位阻因子H就变得很重要，这时的扩散又常称为受阻扩散。在微孔内进行扩散时，有效扩散系数比在主体溶液中扩散明显减小，对于常用固定化凝胶，大约为0.5～0.8。某些底物在生物凝胶中的有效扩散系数（水溶液）凝胶种类胶浓度（质量%）底物温度（℃）有效扩散系数（m2/s）海藻酸钙2葡萄糖256.1×10－10海藻酸钙2乙醇251.0×10－9海藻酸钙2色氨酸306.67×10－10明胶3.8蔗糖52.09×10－10明胶5.7蔗糖51.86×10－10明胶7.6蔗糖51.35×10－10明胶25乳糖50.37×10－103．微孔内反应组分的浓度分布在微孔内扩散和反应同时进行，因而沿着从外到里的方向，底物浓度和反应速度同时在下降。要描述浓度及反应速度的变化规律，必须首先建立包括扩散和反应在内的质量衡算方程式。由于内扩散状况与固定化酶颗粒的形状有关，并且固定化酶颗粒多为球形，下面就以球形固定化酶颗粒为讨论对象。

（1）质量衡算方程