第九章 分子定向进化

第八章分子定向进化育种

一、酶定向进化发展历史

定向进化是近20年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。二、理性设计寡核苷酸引物介导的定点突变PCR介导的定点突变盒式突变

点饱和突变技术是通过对目的蛋白的编码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。它不是定点突变技术的简单延伸,而是蛋白质设计理念的全面升华,广泛地应用于蛋白质改造及结构—功能关系研究中,并取得了一系列令人瞩目的成绩。如利用点饱和突变技术鉴定蛋白质功能位点,提高酶比活力,改善酶热稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性等多方面性质。1、寡核苷酸定向诱变该方法于上世纪70年代末建立,将目的基因克隆到噬菌体M13单链表达载体上,然后合成一段在靶位点处含突变寡核苷酸的引物,使其与目的基因配对,再加入四种dNTP和KlenowDNA聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全长基因,获得的重组双链DNA分子转染细菌后大量复制,进而筛选出阳性突变子。优点:目的基因可插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因内,通过噬菌体表面展示技术可方便地筛选出重组子。不足之处:(1)对19种氨基酸须分别设计各自寡核苷酸引物,费用较大;(2)大肠杆菌宿主细胞存在自身修复系统,因突变修复而难以筛选出突变子;(3)不适合多点饱和突变。2、盒式诱变

该法利用一种含有突变靶位点和特殊酶切位点序列的密码子盒(codoncassette)来引入突变序列。由于密码子盒可从正反两方向插入目的基因,因此只须11种密码子盒就可替换产生全部20种氨基酸以达到点饱和突变的效果。该法突出优点是:一个靶位点两侧的酶切位点经过改造可替换成其它氨基酸,相对于寡核苷酸定向诱变而言节省了引物合成的费用,而且可对多个非邻近位点同时进行点饱和突变。不足之处是:(1)每个靶位点两侧需分别设计酶切位点;(2)密码子盒两端存在重复序列,因自连而增加突变子筛选难度。3、基于PCR的点饱和突变1）、突变引物诱变当靶位点位于基因两端时,可设计这样一对引物扩增目的基因,正向引物为靶位点突变的兼并引物,反向引物为目的基因序列引物。突变引物诱变是基于PCR的点饱和突变中最简单、最快速的方法,但难以对基因中间的靶位点进行点饱和突变。2）、重叠延伸PCR

设计一对简并引物,使其在靶位点附近有一定程度的重叠(图2中的B、C引物),分别与基因5′和3′端引物(图2中的A、D引物)组合,扩增含突变靶位点的上游片段和下游片段,然后将上下游片段在靶位点处交错,互为模板重叠延伸成全长基因。

图2重叠延伸PCR技术流程A、D分别表示基因上下游引物；B、C分别表示靶位点正反向突变引物；基因上的黑色区域为靶位点，NNN表示兼并引物或突变核苷酸该法主要优点:(1)能方便地对基因中间的靶位点进行点饱和突变,解决中间靶位点不易突变的难题;(2)突变与重组同时完成,大大缩短实验周期;(3)不存在突变修复问题,容易筛选出全部突变子;(4)可方便地进行多点饱和突变。不足之处是:当靶位点靠近目的基因末端时,分段扩增的片段过小而不易回收;分别扩增上下游片段时,不能使用具有无模板加尾性能的polI型耐热DNA聚合酶,而应使用无加尾性能的高保真α型或混合型耐热DNA聚合酶。3、质粒扩增诱变

在靶位点处设计一对反向兼并引物,扩增质粒全长片段,然后用DpnI消化含甲基化位点的亲本链,新合成链由于没有甲基化位点而被保护。由于此法需要扩增质粒全长序列,因此在PCR反应中应特别注意扩增的保真性,一般采用高保真α型或混合型耐热DNA聚合酶。常用点饱和突变技术特性的比较三、非理性设计—蛋白质（酶）定向进化

（一）进化策略特征：（1）进化的每一关键步骤都受到严密控制。（2）除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径；（3）能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。（二）定向进化常用方法1.易错PCR为代表的无性进化2.DNA改组技术为代表的有性进化3.基因家族之间的同源重组4.杂合酶(1)杂合酶(2)构建策略

1、易错PCR是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法，它通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。本法的关键在于选择适当的突变频率，当突变频率太高时，几乎无法筛选到有益突变；若突变频率太低，野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想的突变体。费力、费时，且易出现同型碱基转换

2、DNAshuffling

1994年,Stemmer在Nature发表了一篇题为RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling的文章,首次提出了DNA改组(DNAshuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试验对象,用DNA改组,经过三轮筛选和两次回交得到一新菌株,其头孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制浓度比原始菌株提高了32,000倍,也远高于易错PCR的突变筛选结果。

DNA改组是DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达产物以新功能。实际上,该技术是一种分子水平上的定向进化。因此也称为分子育种。在创造新基因的过程中,要设法产生各种变异。这主要通过有性PCR、交错延伸PCR完成。值得指出的是,DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此,灵敏可靠的筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。DNA改组是基因在分子水平上进行的有性重组，是一种反复性突变、重组的过程。主要包括以下步骤：（1）目的DNA片段的获得；（2）目的基因的随机片段化，即将目的基因（可以是单个基因或一组相关基因）酶切成随机片段，这些随机片段集合包含了来自不同的同源序列的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同的3’末端，从而为下一步的无引物PCR提供了条件；（3）无引物PCR，即具有互补3’末端的寡核苷酸互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环，在不同模板上随机互补结合并进一步延伸；（4）有引物PCR，即以上轮无引物PCR的产物为模板，加入基因两端序列为引物，经过多轮PCR得到重排产物的集合，称为突变文库；（5）克隆、筛选、分析及多轮筛选，即进一步对突变文库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮改组的模板，重复上述步骤进行多次重排和筛选，最终获得性状比较理想的突变体。优点：①DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb；②通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；③DNA改组从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序；④DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率。研究表明，DNA改组比随机突变具有较大的优势，随机突变的方法一般产生1%的良性突变，但DNA改组可产生13%的良性突变。

Canada等通过对BurkholderiacepaciaG4来源的甲苯单加氧酶进行体外定向分子进化,以提高其对氯乙烯和萘氧化物的活性。经过体外分子进化,获得活性提高的突变酶。在大肠杆菌中表达突变的突变酶,其降解三氯乙烯、二氯乙烯速率明显加快。表达突变酶的整个细胞的合成1-萘酚速度比野生型的突变酶快6倍,而且突变酶其区域专一性没有改变。进一步研究发现,在大肠杆菌中表达的突变酶表现出对三环复合物菲、芴和蒽较野生型更快的氧化效率。Dai等使用基因改组提高了S.chlorophenolicum降解五氯苯酚的水解能力和对高浓度五氯苯酚的耐受力。Bosma等构建了一个能够在三氯丙烷培养基中生长的生物体。在亚甲基曙红兰的平板上选择对降解三氯丙烷活性提高的卤代烷脱卤酶,经过两轮体外定向进化,获得含有两个氨基酸位点的突变,Cys176Tyr和Tyr273Phe,表现出比野生型对三氯丙烷脱卤效率提高8倍的卤代烷脱卤酶。

Crameri等通过DNAshuffling技术来改造砷抗性基因,通过三轮的改组和筛选,得到了对砷的抗性提高40倍的突变体,虽然在还原酶的基因里并未发现突变,但还原酶的活性提高了近10倍,推测可能是侧翼序列突变引起的。Suenaga等在序列分析的基础上,结合推理设计,构建了12个定点的bphA1突变,其中3个突变酶改变了多氯联苯复合物的降解特异性区域。尤其是Ile335Phe突变体在提高了降解多氯联苯的能力外,还具备了降解2,3-双加氧酶和3,4-双加氧酶的活性。Keenan等还获得了活性提高11、14、15倍的萘双加氧酶,另外在单加氧酶的功能改进方面取得了较好的进展。

3、DNA家族改组

Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改组”的概念。他们发现,采用传统的DNA改组方法虽然能完成定向进化的目的,但其中随机产生的多为点突变,且有益突变频率低,导致筛选工作艰巨且进展缓慢。

该技术打破不同种、属间的遗传界限,利用同源基因之间的同源序列进行DNA改组,通过提高亲本基因群中差异的组合频率和改组子代的杂合度,以增加突变文库的多样性,提高突变文库的质量,进而有效地产生满足需要的突变体。与其他DNA改组技术相比,DNA家族改组技术不仅可以显著加速有益突变的累积,还易于实现目的蛋白多种特性的共进化。

进行基因组改组首先需要有一个含有各种不同正突变的基因组库(例如:通过经典的诱变育种得到目的性状发生改进的不同的正突变菌株就构成了所需的基因组库),随后通过原生质体融合将这些正突变菌株的全基因组进行随机重组,并筛选目的性状得到进一步改进的菌株来进行下一轮基因组改组,这样,通过循环多轮的随机重组可以快速、高效地选育出表型得到较大改进的杂交菌种。DNA家族改组的经典技术路线

Kumamaru等对P.pseudoalcaligenesKF707的bphA1（联二苯双加氧酶）基因和Burkholderia

sp.strainLB400的bphA基因进行了体外分子进化改造,提高了菌株对多氯联苯的降解能力,还扩大了菌株的降解范围。经改组和筛选获得的bph突变基因在大肠杆菌细胞培养,对乙苯、丁苯和异丙苯降解能力较野生型高。successfuluses

Barriault等针对联二苯双加氧酶基因的片段进行改组。其中联二苯双加氧酶的同源基因片段分别来源于Burkholderiasp.,Comamonastestosteroni和Rhodococcusgloberulus。研究者在较小的库容内筛选到的新酶不仅对2,2-二氯联苯、3,3-二氯联苯和4,4-二氯联苯活力提高,而且对不易分解的2,6-二氯联苯也具有良好的氧化能力。

基因组改组重组几个菌株同源染色体可以提高整个生物体的活性。该方法已用于生物修复中五氯酚的降解，Dai等通过三轮基因组改组将Sphingobilumchlorophenolicum对剧毒杀虫剂五氯苯酚的耐受浓度提高了10倍以上,并可将培养基中所含的3mmol·L-1五氯苯酚完全降解。

Vezina等借助DNA家族改组技术探索了苯双加氧酶BPDOs底物的立体专一性和结构之间的关系,获得了对2,2’-CB(2,2’-二氯联苯)中C5和C6的氧化活性