PCR、引物设计及逆转录PCR

PCR（PolymeraseChainReaction)技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质。PCR的基本原理PCR扩增体系模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可以使细菌、组织样品等。引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定扩增产物长度。DNA聚合酶（DNAPolymerase）：推动PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子强度，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本组成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。Mg2+、K+、增强剂1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（95℃，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（45～65℃，30s）。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（

72℃，30～60s）。PCR的基本原理高温变性低温退火中温延伸理论：2n递增（n为循环次数），如果扩增30循环，目标DNA可增加230也就是109倍。实际：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。PCR扩增曲线1.早期（E期）:引物在单链DNA模板上搜索互补序列，并与特定位点杂交。2.中期（M期）：扩增反应顺利进行，产物呈指数型增长。3.晚期（L期）：平台期，DNA聚合酶过度损耗或者产物的抑制。PCR扩增条件循环PCR反应条件94℃5min94℃30s56.2℃30s72℃30s72℃7min4℃∞PC1-P20：模板：基因组DNA；产物：506bp举个例子PCR体系（10μL）模板：1μL上游引物：0.2μL下游引物：0.2μLEasyTaq酶：0.1μLEasyTaqBuffer：1μLdNTP：0.8μLddH2O：6.7μL30个循环1.避免PCR试剂的污染2.最适合的反应条件3.设置对照组：①PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。②PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片段代替目的模板。③PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功进行特异性扩增的模板。PCR的注意事项1.为什么完全没有PCR扩增产物？①试剂质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。②聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。③PCR仪温度控制不精确。④模板DNA发生降解。⑤引物或反应温度设计不合理⑥靶片段GC含量过高或扩增对象长多常见问题2.为什么出现多条非特异性条带？①反应体系被污染。②引物特异性差。③退火温度不合适。常见问题3.为什么PCR产物很少？①聚合酶活性过低。②循环次数偏低。③模板DNA浓度过低。常见问题4.为什么PCR产物出现片状拖尾？①DNA聚合酶过多或酶活性差。②dNTP和Mg2+浓度过高。③退火温度过低，PCR循环数偏多。④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特意扩增。常见问题普通PCR仪温度梯度PCR仪实时荧光定量PCR仪为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物是PCR特异性反应的关键，同时也与PCR扩增的效率密切相关。引物设计的最重要的原则：最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计的目的1、引物应具有足够的特异性。如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。引物与非特异序列的同源性不超过70%或有连续8个互补碱基。

NCBIPrimerBLAST

引物设计的基本原则2、避开易形成二级结构的模板序列区域。

分子内互补、发夹结构、分子间互补。

二级结构会这家引物与模板杂交以及PCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区域。

用有关软件预测mRNA的稳定二级结构。

引物设计的基本原则3、引物长度一般为18-30个碱基之间。引物长度与反应的特异性和解链温度成正相关。过短：扩增特异性下降过长：引物自身形成二级结构，以及引物二聚体。引物设计的基本原则4、G+C含量一般为40%-60%引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于从模板上解离。G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。引物设计的基本原则5、Tm值之差应小于1℃，最适退火温度在55-60℃。一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR扩增效率下降或失败。对于20bp左右的引物：Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）

一般情况下，PCR的最佳退火温度比引物Tm值低5℃左右。引物设计的基本原则6、引物中四种碱基最好是随机分布的避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否则会使引物在G+C富集序列区域产生错配，降低扩增的特异性。引物设计的基本原则7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身互补——发夹结构

引物之间互补——二聚体

引物自身连续互补碱基不应超过3个，引物之间连续互补碱基不应超过4个，尤其避免3’端的互补重叠。引物设计的基本原则8、引物的5’端可以修饰，3’端不可以修饰。引物的5’端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生物素、引入点突变等。

由于延伸是从3’端开始的，所以不能进行任何修饰。引物设计的基本原则9、引物的3’端不可以A结尾。引物3’端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3’端最好选择T。引物设计的基本原则10、引物3’端要避开密码子的第3位。如扩增序列位于基因编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。引物设计的基本原则1、避免重复碱基，尤其是G。2、引物退火温度在58-60℃之间。

3、G+C为30-80%。

4、3’端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。5、引物的产物大小一般在80-250bp之间；80-150bp最为合适（可以延长至300bp）。

Real-TimePCR引物设计原则6、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。7、Real-TimePCR引物的扩增产物应跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，以避免基因组DNA污染影响。

Real-TimePCR引物设计原则PrimerPremier5.0Oligo6Primer3（在线）Primer-BLAST（在线）引物设计常用软件FileNewDNAsequence粘贴模板序列引物搜索引物位置产物大小引物长度PrimerBLAST由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作逆转录PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR），由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。

逆转录PCR的原理逆转录PCR的原理逆转录PCR的反应体系1、模板RNA2、逆转录酶3、逆转录引物Thanks！

93-96℃，较高的温度变性更快更彻底，尤其是对富含G+C的靶序列而言。

退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。退火温度可以通过计算推断，通常采用温度梯度PCR的方法进行摸索。

45.045.546.949.051.453.856.258.660.963.164.565.0MPC1-P20退火温度摸索

延伸的温度通常为所以DNA聚合酶的最适工作温度，一般为72℃；延伸的时间主要取决于目的片段的大小，不同种类的聚合酶的合成效率也不同，因此还与DNA聚合酶的种类有关。EasyTaq：1-2kb/minTransStartTaq:1-2kb/minFastPfu:2-4kb/min循环数：

在其他参数都已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。一般情况下30-35个循环即可。循环数太多：会增加非特异扩增产物的数量和复杂性。循环数太少：PCR产量太低。逆转录引物：

（1）随机六聚核苷酸引物

仅长6个核苷酸，每个核苷酸位点上随机加入4中不同的脱氧核苷酸，因此是46中不